王 煒，鄭學(xué)禮

抗菌肽廣泛分布于自然界中，存在于許多昆蟲體內(nèi)［1－2］。在生物體對(duì)抗微生物中扮演著重要角色［3］。到目前為止，未發(fā)現(xiàn)耐抗菌肽的細(xì)菌出現(xiàn)?？咕淖鳛橐环N潛在的抗菌藥物倍受關(guān)注。天蠶素最早是從家蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種具有抗菌活性的多肽，已證明具有廣譜、高效的抑菌效能［4］。分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，抗菌機(jī)制明確［5］，對(duì)動(dòng)物免疫原性低、無毒性［4］，是很好的潛在抗菌藥物［6］。但是從生物體中分離純化天蠶素費(fèi)時(shí)、效率低；而人工合成天蠶素成本高，均無應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是一種技術(shù)成熟、低成本的重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。由于抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用和細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的敏感性［7］，不能直接在細(xì)菌表達(dá)體系中表達(dá)。我們通過生物信息學(xué)方法分析MC的天然結(jié)構(gòu)，采用伴侶分子融合改變結(jié)構(gòu)的策略［8－12］，在大腸桿菌中表達(dá)MC分子。為能夠在融合蛋白質(zhì)表達(dá)后，獲得家蠅天蠶素成熟肽（M．domestica mature cecropin，MC），我們?cè)诜肿影閭HTrx分子和天蠶素分子之間加入色氨酸殘基，設(shè)計(jì)構(gòu)建胃蛋白酶水解位點(diǎn)，便于MC從融合蛋白質(zhì)中釋放。

本研究構(gòu)建Thioredoxin＆MC融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體，在大腸埃希氏菌中成功表達(dá)了具有生物活性的抗菌肽分子，并證明其生物活性。

1 材料與方法

1．1 試劑 T4DNA連接酶，XhoI、HindⅢ限制性內(nèi)切酶，RT－PCR試劑盒，Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司，TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司，DEPC、IPTG、DNA Marker、氨芐青霉素均購(gòu)自北京鼎國(guó)，其余試劑均為分析純。pET32a表達(dá)質(zhì)粒由本室保存。家蠅成蟲，由廣東省疾病控制中心提供，本室飼養(yǎng)。

1．2 家蠅天蠶素基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建 取10條家蠅3齡幼蟲，細(xì)針蘸E．coli針刺其體壁，每蟲1針，誘導(dǎo)Cecropin A基因表達(dá)。處理后置于燒杯內(nèi)，室內(nèi)飼養(yǎng)24h。根據(jù)GenBank登錄的天蠶素基因（登錄號(hào)為AF416602）設(shè)計(jì) MC（114bp）基因序列引物，并在5′端、3′端按分別加入HindⅢ與XhoI限制性酶切位點(diǎn)。在HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)后加入色氨酸密碼子（TGG）。按照TRIzol試劑說明書抽提總mRNA。按照TaKaRa RT－PCR試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增MC基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用PCR凝膠回收試劑盒回收純化PCR擴(kuò)增片段。使用HindⅢ與XhoI限制性酶同時(shí)酶切純化的PCR產(chǎn)物及pET32a質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物經(jīng)離心沉淀重懸后混合，混合物中加入T4DNA連接酶過夜連接構(gòu)建pET32a－MC重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5（中。菌落PCR篩選陽性克隆。

1．3 pET32a－MC重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 從大腸埃希菌DH5（中提取重組質(zhì)粒pET32a－MC轉(zhuǎn)化入表達(dá)細(xì)菌大腸埃希菌BL21中。挑取pET32a－mc／BL21單菌落，35℃過夜培養(yǎng)，次日離心過夜培養(yǎng)的菌液，用新鮮培養(yǎng)液將菌液的OD600值調(diào)整到0．8。加入終濃度為1mmol／L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h。取1．5mL菌液，用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析pET32a－MC重組質(zhì)粒的蛋白質(zhì)表達(dá)。

1．4 Trx＆MC融合蛋白質(zhì)的純化及水解 取1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液500ml離心沉淀。沉淀菌按照QIAGEN公司Ni－NTA Agarose操作說明書純化重組蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)加入透析袋中透析除去咪唑。將透析袋包埋在蔗糖中，4℃進(jìn)行濃縮。蛋白質(zhì)濃縮液加入pH 1．3的磷酸：磷酸一氫鈉緩沖液及胃蛋白酶。蛋白質(zhì)溶液放入37℃恒溫?fù)u床過夜水解。過夜消化的蛋白液用0．5 mmol／L碳酸氫鈉調(diào)整溶液pH值為7．0。蛋白水解液加入透析袋中，放入PBS緩沖液4℃過夜透析復(fù)性。過夜復(fù)性的透析袋放入蔗糖中，于4℃下濃縮蛋白質(zhì)。

1．5 Trx＆MC融合蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的分析 取50μL融合蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，加入2×SDS樣品緩沖液，沸水中加熱30s，使用4%層積膠和16%分離膠的Tricine－SDS－PAGE分析結(jié)果。30V跑完層積膠，100V跑完分離膠。電泳完成后立即將膠放入含甲醛的固定液中30min，取出后放入ddH2O中10min，后用考馬斯亮蘭染色。

1．6 MC體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用細(xì)菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定MC在體外的生物活性。將胃蛋白酶溶液、純化的融合蛋白質(zhì)溶液和MC濃縮液濃度調(diào)整0．035mg／mL（下同）。從過夜培養(yǎng)的大腸埃希菌DH5（菌液中分別吸取15mL菌液移入不同的5個(gè)新錐形瓶中，分別加入5mL MC液、胃蛋白酶液、融合蛋白質(zhì)液和5mL LB培養(yǎng)液、終濃度為50μg／mL的氨芐青霉素。37℃，250r／min振蕩器中培養(yǎng)，每h取樣測(cè)量菌液OD600值。

2 結(jié) 果

2．1 家蠅天蠶素基因的克隆 RT－PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖1所示，在100bp～200bp DNA Marker處有一特異擴(kuò)增條帶，大小與理論值相符。

圖1 家蠅MC基因擴(kuò)增結(jié)果M：100bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．1 Results of amplification on MC gene1：The PCR products of MC；M：DNA Marker 100

2．2 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白質(zhì)的純化重組菌pET32a－mc／BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)物及純化重組蛋白質(zhì)Trx＆MC，用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析結(jié)果見圖2。

圖2 SDS－PAGE分析結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1：誘導(dǎo)前的BL21空菌；2：誘導(dǎo)后的BL21空菌；3：誘導(dǎo)前的pET32a／BL21；4：誘導(dǎo)后的 pET32a／BL21 ；5：誘導(dǎo)前的 pET32a－mc／BL21；6：誘導(dǎo)后的pET32a－mc／BL21；7：純化后的重組蛋白Fig．2 The SDS－PAGE analysis of the recombinant proteinM：Protein marker；1：The protein expression of BL21without induction by IPTG；2：The protein expression of BL21with induction by IPTG；3：The protein expression of pET32a／BL21without induction by IPTG；4：The protein expression of pET32a／BL21with induction by IPTG；5：The protein expression of pET32a－mc／BL21without induction by IPTG；6：The protein expression of pET32a－mc／BL21with induction by IPTG；7：The purified recombinant protein．

2．3 重組蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物分析 Trx＆MC融合蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶在pH 1．3、37℃條件下水解。水解產(chǎn)物用Tricine－SDS－PAGE分析，結(jié)果如圖3所示，可見兩條蛋白質(zhì)帶，一條蛋白質(zhì)帶處于35kDa蛋白質(zhì)Marker旁，其大小與胃蛋白酶分子質(zhì)量35 kDa相符。另一條蛋白質(zhì)帶小于8kDa蛋白質(zhì)Marker，與MC理論值4kDa相符，見圖3。

圖3 Tricine－SDS－PAGE結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1：融合蛋白質(zhì)水解液；Fig．3 Tricine－SDS－PAG analysis of hydrolyzateM：Marker；1：Hydrolyzate

2．4 天蠶素體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在相同OD600值的BL21（DE3）大腸桿菌中，加入終濃度為0．035 mg／ml的MC、Trx＆MC、胃蛋白酶和LB液體培養(yǎng)基及氨芐青霉素溶液，每隔1h取樣一次測(cè)量各樣品中菌液的OD600值，并繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，見圖4。

圖4 液態(tài)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)Fig．4 The inhibition growth experiment in liquid

3 討 論

天蠶素已經(jīng)從很多昆蟲體內(nèi)分離出來［13］，他們結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量小，具有廣譜的抗革蘭氏陰性菌和某些真菌的活性［14］，具有很好的藥物開發(fā)潛能。在我們的研究中，從家蠅體內(nèi)克隆出天蠶素基因序列，并重組入大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中，以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)出了天蠶素成熟多肽分子。Trx作為伴侶分子將MC分子包裹到其分子內(nèi)部，消除了MC對(duì)原核宿主的殺傷作用。重組蛋白質(zhì)胃蛋白酶水解產(chǎn)物Tricine－SDS－PAGE分析顯示天蠶素分子成功從融合蛋白質(zhì)內(nèi)分離出來。

從抑菌試驗(yàn)的結(jié)果中可以看出Trx＆MC融合蛋白質(zhì)在最初的幾小時(shí)內(nèi)可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但在后期會(huì)失去作用。而MC可以很好的抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，且抑菌時(shí)間較長(zhǎng)。比較融合蛋白質(zhì)水解前后的生物活性變化可以看出，分子伴侶Trx不能完全抑制MC分子的生物活性，但可以大大減輕MC分子對(duì)大腸埃希菌的抑制活性。細(xì)菌對(duì)融合蛋白質(zhì)的抑制作用會(huì)產(chǎn)生耐受。

為了排除死亡細(xì)菌對(duì)OD值的影響，最后用接種環(huán)蘸取加有MC和氨芐青霉素的菌液劃板，次日觀察到氨芐青霉素處理的菌液沒有菌落長(zhǎng)出，而MC處理的菌液有菌落長(zhǎng)出。因此可以得出MC只能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，不像氨芐青霉素能將其完全殺死。

［1］Gabay JE．Ubiquitous natural antibiotics［J］．Science，1994，264（5157）：373－374．DOI：10．1126／science．8153623

［2］Steiner H，Hultmark D，Engstr?m A，et al．Sequence and speci－ficity of two antibacterial proteins involved in insect immunity［J］．Nature，1981，292（5820）：246－248．

［3］Boman HG．Peptide antibiotics and their role in innate immunity［J］．Annu Rev Immunol，1995，13：61－92．DOI：10．1146／annurev．iy．13．040195．000425

［4］Shin SY，Kang JH，Jang SY，et al．Effects of the hinge region of cecropin A（1－8）magainin 2（1－12），a synthetic antimicrobial peptide，on liposomes，bacterial and tumor cells［J］．Biochim Biophys Acta，2000，1463（2）：209－218．DOI：10．1016／S0005－2736（99）00210－2

［5］Dathe M，Wieprecht T．Structural features of helical antimicrobial peptides：their potential to modulate activity on model membranes and biological cells［J］．Biochim Biophys Acta，1999，1462（1－2）：71－87．DOI：10．1016／S0005－2736（99）00201－1

［6］Hancock RE，Lehrer R．Cationic peptides：a new source of antibiotics［J］．Trends Biotechnol，1998，16（2）：82－88．DOI：10．1016／S0167－7799（97）01156－6

［7］Skosyrev VS，Kulesskiy EA，Yakhnin AV，et al．Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA inEscherichiacolicells［J］．Protein Expr Purif，2003，28（2）：350－356．DOI：10．1016／S1046－5928（02）00697－6

［8］Smith DB，Johnson KS．Single－step purification of polypeptides expressed inEscherichiacolias fusions with glutathione S－transferase［J］．Gene，1988，67（1）：31－40．DOI：10．1016／0378－1119（88）90005－4

［9］Pryor KD，Leiting B．High－level expression of soluble protein inEscherichiacoliusing His6－tag and maltose binding－protein double affinity fusion system［J］．Protein Expr Purif，1997，10（3）：309－319．DOI：10．1006／prep．1997．0759

［10］di Guan C，Li P，Riggs PD，et al．Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides inEscherichiacoliby fusion to maltose－binding protein［J］．Gene，1988，67（1）：21－30．

［11］LaVallie ER，DiBlasio EA，Kovacic S，et al．A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation inE．colicytoplasm［J］．Biotechnology（NY），1993，11（2）：187－193．

［12］Tenno T，Goda N，Tateishi Y，et al．High－throughput construction method for expression vector of peptides for NMR study suited for isotopic labeling［J］．Protein Eng Des Sel，2004，17（4）：305－314．DOI：10．1093／protein／gzh044

［13］Boman HG．Cecropins：antibacterial peptides from insects and pigs［M］．In：Hoffmann JA，Janeway CAJ，Natori S，editors．Phylogenetic perspectives in immunity：the insect host defense．Austin：R．G．Landes Company．1994：3－17．

［14］DeLucca AJ，Bland JM，Jacks TJ，et al．Fungicidal activity of cecropin A［J］．Antimicrob Agents Chemother，1997，41（2）：481－483．