原 靈，陳愛平，楊勁松，林震宇

軍團病是近20年以來新發(fā)現(xiàn)傳染病之一，并且該病已成為世界各國及我國普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。

為進一步了解福建省嗜肺軍團菌分子特征，作者采用脈沖場凝膠電泳（pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）分型技術(shù)對福建省2008－2010年公共場所中央空調(diào)冷卻塔水及冷凝水中分離到的嗜肺軍團菌主要血清型別血清Ⅰ型（LP1）及Ⅵ型（LP6）菌株進行基因分型研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 菌株 57株LP1及15株LP6嗜肺軍團菌均為我省2008－2010年公共場所中央空調(diào)冷卻塔水及冷凝水污染狀況調(diào)查中分離菌株，并經(jīng)形態(tài)染色、生化鑒定、血清學(xué)凝集試驗鑒定為LP1型及LP6型及經(jīng)PCR確認的嗜肺軍團菌。菌株來源于我省7個設(shè)區(qū)市；PFGE實驗分子量標準對照沙門菌（Braenderup）H9812菌株，由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1．2 主要試劑 乳膠凝集試劑購自英國OXOID公司；軍團菌診斷血清購自日本生研會社，均在有效期內(nèi)使用。GVPC平板、BCYE－α平板購自廣州環(huán)凱在有效期內(nèi)。Seakem Gold Agarose PFGE級瓊脂糖購自法國Lonza公司，AscⅠ限制性內(nèi)切酶（10U／μL）、XbaI限制性內(nèi)切酶（20U／μL）以及蛋白酶 K購自美國 NEB公司，Tris、EDTA、硼酸等試劑購自上海生工公司。

1．3 主要儀器 TGL－16B臺式高速離心機、水平電泳槽、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、三聯(lián)抽濾裝置（濾膜 Millipore，0．45μm）；美國 Bio－Rad公司的 CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀和Gel Doc XR＋ 凝膠成像系統(tǒng)，法國BioMérieux Vitek公司的DENSIMAT細菌濁度儀。分析軟件為BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）軟件包。

1．4 方法

1．4．1 脈沖場凝膠電泳 方法由中國CDC傳染病預(yù)防控制所呼吸道傳染病室提供。軍團菌用AscI酶切，每樣品用量為20U。H9812用XbaI酶切，每樣品用量為40U。電泳條件：6．8s～54．2s，18h。膠塊經(jīng)染色、脫色后置于 Gel Doc XR＋ 凝膠成像系統(tǒng)成像。

1．4．2 聚類分析 PFGE圖像導(dǎo)入BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）軟件包進行處理，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法，tolerance設(shè)置為1．5%。

根據(jù)每兩個圖像之間的相似性系數(shù)，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié) 果

2．1 嗜肺軍團菌菌株P(guān)FGE電泳 57株嗜肺軍團菌LP1血清型菌株及15株嗜肺軍團菌LP6血清型菌株用Asc I限制性內(nèi)切酶酶切后進行脈沖場凝膠電泳，部分Lp1型嗜肺軍團菌PFGE酶切指紋圖譜，見圖1。

圖1 LP1型嗜肺軍團菌PFGE酶切電泳圖譜（AscⅠ內(nèi)切酶）M：H9812沙門菌標準株，2－9：軍團菌Fig．1 PFGE profile of serotype I Legionella pneumophilaisolates digested with Asc IM：Salmonellareference strain H9812，lane 2－9 Legionella pneumophilaisolates

2．2 嗜肺軍團菌菌株P(guān)FGE電泳圖譜的聚類分析

2．2．1 57株LP1型嗜肺軍團菌菌株聚類分析 57株LP1型嗜肺軍團菌菌株用AscI酶切電泳后，得到大小從20～1 200kb的電泳片段，不同的菌株條帶數(shù)從6～15不等，按照100%的相似度，57株菌株可分為40個不同的PFGE型別，命名為A0001～A0040。大部分帶型只包含1個菌株數(shù)，其它少部分帶型包含菌株數(shù)為2～4株，不同菌株的相似系數(shù)在24．107%～100%之間，見圖2。

圖2 57株LP1型嗜肺軍團菌PFGE聚類分析Fig．2 Cluster analysis for 57strains of serotype I Legionella pneumophila

2．2．2 15株LP6型嗜肺軍團菌PFGE聚類分析對15株LP6型嗜肺軍團菌用AscI酶切電泳后，可得到大小從20～1 300kb的電泳片段。不同的菌株條帶數(shù)從5～15條不等，見圖3。按照100%的相似度，15株菌株可分為12個不同的PFGE型別，命名為B0001～B0012。大部分帶型包含1個菌株數(shù)，少部分帶型包含2個菌株數(shù)，不同菌株的相似系數(shù)在27．87%～100%之間。

圖3 15株LP6型嗜肺軍團菌PFGE聚類分析Fig．3 Cluster analysis for 15strains of serotype VI Legionella pneumophila

2．3 57株LP1嗜肺軍團菌不同地區(qū)的菌株相似性系數(shù) 從公共場所中央空調(diào)冷卻塔水中分離出的57株LP1型嗜肺軍團菌，分別來自福州市、廈門市、泉州市、漳州市、龍巖市、三明市（1株）、莆田市（1株）。菌株全染色體DNA酶切圖譜采用BioNumerics軟件進行聚類分析，福州、廈門、泉州、漳州和龍巖的菌株數(shù)分別為7、11、10、8、19株；而相似性系數(shù)分別為：79．9%～100%、42．31%～100%、56．23%～100%、36．48% ～95．24%和 22．04%～100%。

3 討 論

近年來，多種分子分型的方法被應(yīng)用于軍團菌的流行病學(xué)調(diào)查研究，如隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、脈沖 場 凝 膠 電 泳 （pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、核酸測序分型（sequence based typing，SBT）等方法的研究均有報道［1－3］，但大部分方法沒有標準化，PFGE由于具有高分辨力和高穩(wěn)定性的特點，已被應(yīng)用到對醫(yī)源性軍團菌感染的調(diào)查中［4］。

在PFGE分型試驗中，限制性內(nèi)切酶的選擇十分關(guān)鍵，目前實驗一般采用SfiI或Not I這兩種在軍團菌基因組中酶切位點較少的限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA［1］，秦天等以AscⅠ為內(nèi)切酶的PFGE分型方法對所有血清型的嗜肺軍團菌和17個非嗜肺軍團菌血清群進行分型能夠獲得高質(zhì)量的電泳圖譜，并且可以用于嗜肺軍團菌的流行病學(xué)調(diào)查［5］，提示AscⅠ應(yīng)成為軍團菌PFGE分型的首選酶。本實驗采用PFGE分型技術(shù)，以AscⅠ為內(nèi)切酶對福建省公共場所中央空調(diào)冷卻塔水及冷凝水中分離到的LP1及LP6軍團菌菌株進行分型，按相似性系數(shù)100%分型，結(jié)果顯示57株LP1型嗜肺軍團菌可分為40種不同的PFGE型別；15株LP6菌株可分為12種PFGE型別，大部分菌株間相似性系數(shù)差異較明顯，可見菌株間親緣關(guān)系較遠，屬于多個克隆系，即沒有優(yōu)勢基因型；福建省公共場所中央空調(diào)冷卻塔水及冷凝水中分離到嗜肺軍團菌血清Ⅰ型和 Ⅵ型基因存在多樣性，未形成相對優(yōu)勢的基因型別，基因型別散在分布的外環(huán)境軍團菌株一般不易于引起人群的暴發(fā)流行，可能是目前福建省極少發(fā)現(xiàn)軍團菌病人的原因之一。另外，不同地區(qū)分離的Ⅰ型嗜肺軍團菌既有差異較大的帶型，也存在相同和相似的帶型。在同一時間點從相同場所分離的菌株存在多種型別，表明同一水系中可以多個克隆系的嗜肺軍團菌共存。福州、龍巖、廈門、漳州均有2～4株不等的菌株，其PFGE條帶100%相同，提示它們在遺傳上可能有緊密的相關(guān)性。從表1顯示，同一地區(qū)，菌株間相似性系數(shù)從22．04%～100%不等，各菌株間親緣關(guān)系較遠，沒有優(yōu)勢PFGE型菌株。

本研究也發(fā)現(xiàn)同一PFGE型在某個地區(qū)內(nèi)可在不同年份連續(xù)出現(xiàn)，如廈門某酒店2008、2009年均出現(xiàn)A24型，龍巖某賓館2008－2010年均出現(xiàn)A27型等，表明在分離菌株的水系中有個特定克隆系的菌株持續(xù)存在，與任宏宇等人的研究結(jié)果相似［6］。而同一PFGE型別也可以在不同地區(qū)的不同時間出現(xiàn)，如A11型就分別出現(xiàn)在2008年的福州、2009年的莆田和2010年的龍巖，軍團菌是如何遷徙傳播到較遠地區(qū)，傳播方式除了外環(huán)境水系的載體作用，是否還存在軍團菌隱性感染者的中介傳播還需要進一步的研究。

根據(jù)有關(guān)文獻［7］報告，福建省近年公共場所外環(huán)境水中（即中央空調(diào)冷卻塔水）軍團菌的監(jiān)測調(diào)查，2008年福建省5設(shè)區(qū)市均有分離到LP1型或LP6型軍團菌，公共場所中央空調(diào)冷卻塔水受嗜肺軍團菌污染程度比較嚴重，且以LP1型為優(yōu)勢血清型，提示公共場所存在潛在的危害，必須加以關(guān)注。本實驗研究首次采用PFGE分型技術(shù)應(yīng)用于福建省環(huán)境水源分離軍團菌菌株的基因分子分型，為今后在分子水平對環(huán)境軍團菌進行監(jiān)測提供我省基因分型基礎(chǔ)資料，同時為分子流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)依據(jù)。

［1］劉元力，胡朝暉，朱慶義．軍團菌分子分型及其流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用［J］．微生物學(xué)雜志，2007，27（4）：83－86．

［2］Ratcliff RM．Sequence 2based classification scheme for the genus Legionella targeting the MIP gene［J］．Journal of Clinical Microbiology，1998，36（6）：1560－1567．

［3］楊夢，程慧鍵，熊長輝．嗜肺軍團菌血清1型基因檢測及分子分型研究［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26（12）：1151－1156．

［4］陳敏、陳明亮、王剛毅，等．2007年上海部分嗜肺軍團菌血清Ⅰ型菌株 PFGE 分 型 研 究 ［J］．環(huán) 境 與 職 業(yè) 醫(yī) 學(xué)，2010，27（6）：356－359．

［5］秦天，任紅宇，周海健，等．脈沖場凝膠電泳用于軍團菌分型能力的評價［J］．疾病監(jiān)測，2011，26（3）：182－186．

［6］任紅宇，朱兵清，周海健，等．環(huán)境水系分離嗜肺軍團菌脈沖場凝膠電泳［J］．疾病監(jiān)測，2009，24（12）：970－973．

［7］原靈，陳愛平，詹鑾峰，等．福建省2008年公共場所中央空調(diào)冷卻塔水軍團菌污染狀況調(diào)查 ［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26（11）：1080－1081．