趙玉玲，馬曉光，李 輝

隨著耐藥結(jié)核病的不斷增加，作為二線(xiàn)藥物的的第三代喹諾酮類(lèi)在結(jié)核病治療中廣為使用，氧氟沙星耐藥菌的檢出也呈上升趨勢(shì)。早期檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)喹諾酮類(lèi)藥物作用靶點(diǎn)為DNA回旋酶，編碼該酶A亞單位的基因gyrA發(fā)生突變與氟喹諾酮類(lèi)耐藥關(guān)系密切［1］。這些耐藥菌耐藥程度、耐藥基因的突變情況及其與耐藥程度間的相互關(guān)系等需要進(jìn)一步的研究。為了解結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐氧氟沙星相關(guān)gyrA基因的突變情況及其耐藥機(jī)制，通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定98株gyrA基因喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinoloneresistance determining regions，QRDR）測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了目前河南省結(jié)核分枝桿菌gyrA基因突變的新特點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來(lái)源 結(jié)核分枝桿菌 H37Rv（菌株號(hào)：ATCC27294）和H37Ra（菌株號(hào)：ATCC35835）由中國(guó)基本預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心參比實(shí)驗(yàn)室提供。126株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均分離自河南省結(jié)核病控制機(jī)構(gòu)，為2007－2010年結(jié)核病患者（男78例，女48例，年齡19～81歲）的標(biāo)本培養(yǎng)物，并經(jīng)噻吩－2－羧酸肼（TCH）對(duì)硝荃苯甲酸（PNB）菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

1．2 方法

1．2．1 藥物敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用比例法藥物敏感性試驗(yàn)，參照［2］。鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、卷曲霉素（CPM）、阿米卡星（AMK）、卡那霉素（KM）和氧氟沙星（OFLX）所采用的濃度分別為：4、0．2、40、2、40、30、30、3μg／mL。氧氟沙星 MIC測(cè)定用羅氏培養(yǎng)基，所用 濃 度 為 0．125，0．25，1，2，4，8，10，16，20，32μg／mL。

1．2．2 PCR擴(kuò)增 采用煮沸離心取上清法提取結(jié)核菌基因組DNA，－20℃凍存?zhèn)溆?。gyrA QRDR部位227bp進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，所 用 引 物 為：gyrA1：5′－GACCGCAGCCACGCCAAG－3′， gyrA2： 5′－AGCATCACCATCGCCAACG－3′，PCR所用擴(kuò)增酶為 Ampli Taq Gold，由生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃4min，然后（94℃1min，60℃1min，72℃1min）共40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。

1．2．3 DNA測(cè)序 測(cè)序所用引物與PCR擴(kuò)增所用引物相同。由生工生物公司完成測(cè)序，所用測(cè)序儀為ABI PRISM 310基因分析儀（Perkin Elmer Applied Biosystems）

2 結(jié) 果

GyrA基因QRDR突變情況 DNA測(cè)序結(jié)果表明，126株臨床分離株gyrA基因95位密碼子均與H37Rv AGC不同，呈現(xiàn)出來(lái)ACC的自然多態(tài)性。氧氟沙星耐藥的98株中，有19株沒(méi)有突變檢出，其余81株（82．6%）檢測(cè)到gyrA基因。其中68株（84%，68／81）帶有94位密碼子的突變，共發(fā)現(xiàn)4種類(lèi)型，GAC→GGC，GCC，TAC，AAC，見(jiàn)表1。導(dǎo)致94Asp→Gly，Ala，Tyr，Asn，其中36株（44．4%，36／81）攜 有 Asp94Gly 突 變，其 余Asp94Asn，Asp94Tyr和Asp94Ala的發(fā)生率各自為31．0%（25／81），4．9%（4／81）和3．7%（3／81）。除了94位密碼子檢出突變以外，74位，90位和91位也發(fā)現(xiàn)有突變發(fā)生，如表1所示，58株（71．6%）氧氟沙星耐藥株攜有Ala90Val突變，16株（19．8%）帶有 Ser91Pro突變，12株（14．8%）帶有Ala74Ser突變?？傊醴承悄退幹曛術(shù)yrA QRDR部位突變發(fā)生于74，94，90和91位密碼子，而在88，89，92和93位沒(méi)有突變檢出。81株gyrA基因突變株中，有30株為單個(gè)位點(diǎn)突變，51株為雙位點(diǎn)突變，占63%（51／81）。在28株氧氟沙星敏感株（MIC小于2μg／mL）中，有3株（其 MIC為1 μg／mL）也有單個(gè)位點(diǎn)突變檢出，分別為Ala90Val，Asp94Gly和Ser91Pro。

表1 81株氧氟沙星耐藥菌株gyrA基因突變特征Tab．1 Mutation character in gryA of 81strains with ofloxacin－resistant

51株（63%）被檢出帶有雙位點(diǎn)突變。雙位點(diǎn)突變之中，Asp94Gly的發(fā)生率較高。有7株（14%）的雙位點(diǎn)突變株攜有Ala74Ser突變。沒(méi)有三位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變發(fā)生。攜有雙位點(diǎn)突變的菌株中，氧氟沙星MIC值相對(duì)較高。在MIC 8～16μg／mL的菌株中，有63%（32／51）攜有雙位點(diǎn)突變，MIC 2～4 μg／mL的菌株中，37．3%（19／51）攜有雙位點(diǎn)突變。MIC小于2μg／mL的敏感株中，未見(jiàn)雙位點(diǎn)突變發(fā)生。

3 討 論

Takiff［3］、George［4］、Kocagoz［5］、Onodera［6］、Ruiru S［7］及 Pitaksajjakul P［8］、Kim H［9］等曾先后研究gyrA基因第90位、94位密碼子的突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的主要因素。本文通過(guò)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)篩選98株耐氧氟沙星結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，發(fā)現(xiàn)氧氟沙星耐藥株gyrA突變總突變率為84%（81／96），且突變主要集中在94，90和91位密碼子而且94位有4種類(lèi)型的突變（Asp→Gly，Ala，Tyr和Asn），這與以往的報(bào)道相一致［3，10－11］。 既往 曾 有 報(bào) 道 88 位 密 碼 子 的 突 變［11］在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的突變特點(diǎn)：一是63%的耐氧氟沙星株（51／81）攜有雙位點(diǎn)突變；二是在所有的雙位點(diǎn)突變株中，14%（7／51）雙位點(diǎn)突變株中攜有Ala74Ser突變，該種突變類(lèi)型在既往結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因研究中鮮見(jiàn)報(bào)道，通常認(rèn)為它僅存在于其它類(lèi)型的細(xì)菌中，在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)生突變非常罕見(jiàn)［3，10－11］。這可能與菌株的來(lái)源不同、不同國(guó)家或地區(qū)對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的選擇使用原則有所差異以及所入選的樣本量大小等因素有關(guān)。另外，除了gyrA基因突變外，是否存在其他的耐藥機(jī)制如：膜通透性降低［13］、藥物主動(dòng)外排出現(xiàn)［14］及gyrB基因突變［3］等導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥，及gyrA基因突變與耐藥水平的相互關(guān)系等需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

我國(guó)氟喹諾酮類(lèi)雖尚為二線(xiàn)抗結(jié)核藥，但由于廣大地區(qū)在臨床治療其他疾病時(shí)廣泛應(yīng)用，因此耐藥形勢(shì)不容低估。以往報(bào)道顯示菲律賓的一項(xiàng)全國(guó)調(diào)查表明［15］，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為27%，氧氟沙星的耐藥率為35%，兩藥的共同耐藥率為17%；但美國(guó)和加拿大結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類(lèi)耐藥罕見(jiàn)［16］。為確保耐多藥結(jié)核病人有針對(duì)性的治療，了解河南省結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制勢(shì)在必行。本研究工作發(fā)現(xiàn)河南地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株gyrA基因雙位點(diǎn)突變率高，表明氟喹諾酮類(lèi)耐藥形勢(shì)不容樂(lè)觀。應(yīng)特別引起注意，采取針對(duì)性措施，特別是對(duì)耐一線(xiàn)藥的耐藥結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的治療中，在選擇二線(xiàn)藥時(shí)應(yīng)充分注意結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類(lèi)耐藥現(xiàn)象，有條件的省級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室可以常規(guī)開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類(lèi)耐藥檢測(cè)，以便指導(dǎo)臨床治療。

［1］Ginsburg AS，JH Grosset，WR Bishai．Fluoroquinolones，tuberculosis，and resistance［J］．Lancet Infect Dis，2003，3（7）：432－442．

［2］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)，結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程［S］，1995，11．

［3］Takiff HE，Salazar L，Guerrero C，et al．cloning and nucleotide sequence of the Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes，and detection of quinolone resistance mutations［J］．Antimicro Agents Chemother，1994，38（4）：773－780．

［4］Alangaden GJ，Manavathu EK，Vakulenko，SB，et al．Characterization of fluoroquinolone resistant mutant strains of Mycobacterium tuberculosis selected in the laboratory and isolated from patients［J］．Antimicrobial Agents Chemother，1995，39（8）：1700－1703．

［5］Kocagoz T，Hackbarth C，Unsal Z，et al．Gyrase mutation in laboratory－selected，fluoroquinolone－resistant，mutants of Mycobac－terium tuberculosis H37Ra［J］．Antimicro Agents Chemother，1996，40（8）：1768－1774．

［6］Onodera Y，Tanaka M，Sato K．Inhibitory activity of quinolones against DNA gyrase of Mycobacterium tuberculosis［J］．Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2001，47，（4）：447－450．

［7］Shi R，Otomo K，Yamada H，et al．Temperature－mediated heteroduplex analysis for the detection of drug－resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC，SURVEYOR nuclease［J］．Microbes and Infection，2006，8（1）：128－135．

［8］Pitaksajjakul P，Worakhunpiset S，Chaiprasert A，et al．gyrA and gyrB mutations in ofloxacin－resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in Thailand［J］．Southeast Asian J Trop Med Public Health，2011 ，42（5）：1163－1167．

［9］Kim H，Nakajima C，Kim YU，et al．Influence of lineage－specific amino acid dimorphisms in GyrA on Mycobacterium tuberculosis resistance to fluoroquinolones［J］．Jpn J Infect Dis，2012，65（1）：72－74．

［10］Cheng AF，Yew WW，Chan EW，et al．．2004．Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone－resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates［J］．Antimicrob．Agents Chemother，2004，48（2）：596－601．

［11］Xu C，Kreiswirth BN，Sreeratsan S，et al．Fluoroquinolone resistance associated with specific gyrase mutations in clinical isolates of multidrug－resistant Mycobacterium tuberculosis［J］．Infect Dis，1996，174（5）：1127－1130．

［12］Ginsburg AS，Sun R，Calamita H，et al．Grosset．Emergence of Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis during continuously dosed moxifloxacin monotherapy in a mouse model［J］．Antimicrob Agents Chemother，2005，49（9）：3977－3979．

［13］Wang JY，Lee LN，Lai HC，et al．Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates：associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure［J］．J Antimicrob Chemother，2007，59：860－865．

［14］Takiff H E，Cimino M，Musso MC，et al．Efflux pump of the proton antiporter family confers low－level fluoroquinolone resistance in Mycobacterium smegmetis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（1）：362－366．

［15］Grimaldo ER，Tupasi TE，Rivera AB．Increased resistance to ciprofloxacin and ofloxacin in multidrug－resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from patients seen at a tertiary hospital in the Philippines［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2001，5（6）：546－550．

［16］Bozeman L，Burman W，Metchock B，et al．Fluoroquinolone susceptibility among Mycobacterium tuberculosis isolates from the United States and Canada［J］．Clin Infect Dis，2005，40（3）：386－391．