韓文東，孫志平，丁悅娜，曹明波，瞿滌

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，上海200032; 2. 上海申美空氣潔凈技術(shù)有限公司, 上海 200050

生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(biosafety level 3 laboratory, BSL-3實(shí)驗(yàn)室)是高致病性病原微生物研究和檢測(cè)的技術(shù)保障平臺(tái)。在《人間傳染的病原微生物名錄》中歸類(lèi)為可引起人類(lèi)或動(dòng)物嚴(yán)重感染性疾病的第2類(lèi)病原微生物(如高致病性禽流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、朊病毒、粗球孢子菌等)的相關(guān)研究應(yīng)在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[1]。國(guó)務(wù)院424號(hào)令《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》規(guī)定，BSL-3實(shí)驗(yàn)室在依法獲得批準(zhǔn)建設(shè)項(xiàng)目后，按照《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489)的規(guī)范建設(shè)并通過(guò)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)的認(rèn)可，所從事的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)需獲得國(guó)務(wù)院衛(wèi)生部或獸醫(yī)主管部門(mén)的許可[2]。為適應(yīng)我國(guó)生物安全實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和管理的需要，新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2008自2009年7月1日起實(shí)施，要求已(在)建的BSL-3實(shí)驗(yàn)室須按照新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行認(rèn)可轉(zhuǎn)換評(píng)審。新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中重點(diǎn)要求改進(jìn)設(shè)施的內(nèi)容：BSL-3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在原位對(duì)排風(fēng)高效空氣(high efficiency particulate air，HEPA)過(guò)濾器進(jìn)行消毒滅菌和檢漏[3]。為適應(yīng)此要求，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)防護(hù)區(qū)內(nèi)HEPA過(guò)濾器排風(fēng)箱體進(jìn)行改造，采用了可進(jìn)行原位消毒和掃描檢漏的設(shè)備 CamContain Ceil-X[4]，通過(guò)連接粒子計(jì)數(shù)器等可在原位進(jìn)行掃描檢漏。該產(chǎn)品雖配置了配套的測(cè)試罩(universal test shroud)，但無(wú)相應(yīng)可實(shí)現(xiàn)原位消毒的配套設(shè)備，而B(niǎo)SL-3實(shí)驗(yàn)室更換排風(fēng)HEPA過(guò)濾器時(shí)，需確保徹底消毒后方能拆卸以保證生物安全。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的具體情況，設(shè)計(jì)消毒樣機(jī)，通過(guò)甲醛熏蒸方法，利用生物指示劑對(duì)核心區(qū)排風(fēng)HEPA過(guò)濾器原位消毒的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌種嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片(SS1.K31)、枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC9372)購(gòu)自北京鑫四環(huán)消毒技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，恥垢分枝桿菌(MC2155)由第四軍醫(yī)大學(xué)徐志凱教授惠贈(zèng)，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由本實(shí)驗(yàn)室課題組保存。

1.1.2試劑胰蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨大豆肉湯 (tryptone soya broth，TSB)購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司，溴甲酚紫(染料含量90%)、無(wú)水D-葡萄糖(純度≥99.5%)購(gòu)自Sigma公司，Difco Middlebrook 7H9 Broth培養(yǎng)基、Difco Middlebrook 7H10瓊脂、 BBL Middlebrook ADC Enrichment培養(yǎng)基、BBL Middlebrook OADC Enrichment培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。消毒劑為37%～40%甲醛溶液(分析純，含10%～15%甲醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)。

1.1.3HEPA過(guò)濾器箱體特征BSL-3實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)排風(fēng)箱體CamContain Ceil-X wall mounted room-side exhaust containment(CX-S-28D38E-18D-F-F-12-F-BK-S-0-16D-0-0-2-S-1)，美國(guó)Camfil Farr公司生產(chǎn)，HEPA過(guò)濾器對(duì)0.3 μm氣溶膠粒子的過(guò)濾效率為99.99%～99.9995%。配套通用測(cè)試罩(UTS to perform pressure decay testing and decontamination)可通過(guò)連接測(cè)試車(chē)進(jìn)行HEPA過(guò)濾器的原位掃描檢漏。排風(fēng)箱體后端連接排風(fēng)管道處設(shè)有密封閥，且測(cè)試罩與箱體后端都配有消毒管道接口，從而可外接循環(huán)消毒風(fēng)機(jī)實(shí)現(xiàn)對(duì)HEPA過(guò)濾器的原位消毒。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌菌片的制備嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片(SS1.K31)，載菌量5×105～106CFU/片；枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC9372)菌片，載菌量5×105～106CFU/片；恥垢分枝桿菌(MC2155)菌片，取培養(yǎng)的菌液(OD450 nm為1.0)100 μl均勻涂布于0.5 cm×1.0 cm濾紙(濾紙購(gòu)自Bio-Rad，Cat No. 1704085)，取100 μl菌液倍比稀釋后接種于Middlebrook 7H10瓊脂(含10% OADC增菌液)平板培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)數(shù)計(jì)算菌片的載菌量；金黃色葡萄球菌(ATCC25923)菌片，取培養(yǎng)的菌液(OD450 nm為1.0)100 μl均勻涂布于0.5 cm×1.0 cm濾紙，取100 μl菌液倍比稀釋后接種于TSB瓊脂平板培養(yǎng)，計(jì)算菌片的載菌量。

1.2.2消毒效果的微生物檢測(cè)甲醛蒸汽熏蒸消毒程序結(jié)束后，將菌片取出，置于含5 ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中，其中嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片90 ℃孵育60 min，培養(yǎng)基為溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液指示劑1 ml，加蒸餾水定容至1 000 ml，高壓蒸汽滅菌121 ℃，15 min)，56 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄；繼續(xù)培養(yǎng)144 h，觀察并記錄細(xì)菌生長(zhǎng)。枯草芽胞桿菌黑色變種菌片培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，加蒸餾水定容至1 000 ml，高壓蒸汽滅菌121 ℃，15 min);恥垢分枝桿菌菌片培養(yǎng)基為Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(含10% ADC增菌液);金黃色葡萄球菌菌片培養(yǎng)基為T(mén)SB培養(yǎng)基。以上3種菌片均置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察并記錄細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3HEPA過(guò)濾器原位消毒菌片的放置將用于消毒檢測(cè)的4種菌片置于24孔板，每種菌6個(gè)菌片/24孔板，共4塊，分別放置于HEPA過(guò)濾器排風(fēng)箱體內(nèi)側(cè)壁的正面、底面、頂面、側(cè)面，待消毒。

1.2.4細(xì)菌菌片培養(yǎng)的結(jié)果判定金黃色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌、枯草芽胞桿菌需在35～37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌菌落且培養(yǎng)液顏色無(wú)變化，則判定為無(wú)菌生長(zhǎng)，即消毒有效；嗜熱脂肪芽胞桿菌需在55～60 ℃培養(yǎng)168 h，肉眼無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌菌落且培養(yǎng)液顏色無(wú)變化，則為消毒滅菌有效。

2 結(jié)果

2.1 用于HEPA過(guò)濾器原位消毒的循環(huán)消毒樣機(jī)的設(shè)計(jì)與消毒程序的確定

2.1.1用于HEPA過(guò)濾器原位消毒的循環(huán)消毒樣機(jī)的設(shè)計(jì)針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室更換的Camfil Farr排風(fēng)HEPA過(guò)濾箱體配套測(cè)試罩及其帶有消毒劑灌注輸出接口的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[4]，設(shè)計(jì)可用于該排風(fēng)箱體消毒的循環(huán)消毒樣機(jī)(圖1)。樣機(jī)尺寸為600 mm×300 mm×450 mm(長(zhǎng)×寬×高)，內(nèi)部平均分為前后兩室。在樣機(jī)的前室內(nèi)放置F50型甲醛熏蒸滅菌器(北京克力愛(ài)爾生物實(shí)驗(yàn)室工程有限公司)與AIRO-SWISS加濕器，以保證甲醛氣體濕度；后室為循環(huán)風(fēng)機(jī)，帶動(dòng)消毒氣體沿排風(fēng)方向定向循環(huán)穿透HEPA過(guò)濾器。

圖1HEPA過(guò)濾器原位消毒的消毒樣機(jī)設(shè)計(jì)圖

Fig.1ModelsterilizerandprocessofsterilizationofHEPAfilterinsitu

1.2.5甲醛蒸汽循環(huán)消毒程序的確定甲醛蒸汽循環(huán)消毒程序分為3個(gè)階段。① 甲醛氣體發(fā)生：向F50型甲醛熏蒸滅菌器注入甲醛溶液(約37%)，45 ml/m3(甲醛氣體在消毒空間內(nèi)比例約16 mg/L)[5]，加熱揮發(fā)甲醛完畢，同時(shí)加濕。② 循環(huán)穿透消毒過(guò)程：?jiǎn)?dòng)循環(huán)風(fēng)機(jī)，甲醛消毒氣體在風(fēng)機(jī)帶動(dòng)下沿排風(fēng)方向穿過(guò)HEPA過(guò)濾器。③ 排出消毒氣體：打開(kāi)CamContain箱體與排風(fēng)管道連接處的密閉閥，開(kāi)啟外接風(fēng)機(jī)15 min，將甲醛氣體排出HEPA過(guò)濾器及消毒樣機(jī)組成的循環(huán)系統(tǒng)。甲醛蒸汽消毒體系濕度約70%。為確定消毒的有效時(shí)間，將嗜熱脂肪芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌菌片(菌片置平皿中)放置于消毒樣機(jī)管道的盲端，連接管道形成自循環(huán)(未連接HEPA過(guò)濾器排風(fēng)箱體)，分別熏蒸2 h和12 h，檢測(cè)甲醛蒸汽熏蒸循環(huán)的消毒效果。結(jié)果顯示，甲醛蒸汽循環(huán)消毒2 h，金黃色葡萄球菌菌片(107CFU/片)培養(yǎng)后培養(yǎng)液澄清透明，而嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片培養(yǎng)后培養(yǎng)液由紫色變成黃色并可見(jiàn)大量細(xì)菌生長(zhǎng)(菌液渾濁)。甲醛蒸汽熏蒸消毒12 h后，嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片培養(yǎng)液為紫色透明狀，未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2 甲醛蒸汽循環(huán)消毒法對(duì)細(xì)菌消毒效果的評(píng)價(jià)

進(jìn)一步采用嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌黑色變種菌片及自制的恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌菌片(表1)，通過(guò)消毒樣機(jī)與CamContain排風(fēng)箱體的消毒接口連接，對(duì) HEPA過(guò)濾器原位甲醛蒸汽循環(huán)消毒法的消毒效果進(jìn)行評(píng)估。首先將含有菌片的24孔板(每種菌片6個(gè)復(fù)孔)分別放置于待消毒HEPA過(guò)濾器排風(fēng)箱體內(nèi)側(cè)壁的正面、底面、頂面、側(cè)面。

經(jīng)甲醛蒸汽循環(huán)消毒作用2 h后，取出菌片，培養(yǎng)24 h，金黃色葡萄球菌菌片和恥垢分枝桿菌菌片肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)；嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片的培養(yǎng)液由紫色澄清變黃色渾濁，枯草芽胞桿菌黑色變種菌片的培養(yǎng)液由淺黃色澄清變深黃色渾濁，均可見(jiàn)菌片附著大量細(xì)菌菌落，與未消毒對(duì)照組培養(yǎng)結(jié)果相似。經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，15 min)的對(duì)照組培養(yǎng)后無(wú)菌生長(zhǎng)(表2)。

表1用于評(píng)估HEPA過(guò)濾器原位消毒的細(xì)菌

Tab.1BiologicalindicatorsforsterilizationofHEPAfilterinsituwithformaldehydesterilization

BacteriaAbbreviationBacterial load on filter (CFU)Culture mediumIncubation temperature (℃)Incubation Time (h)Bacillus stearothermophilusB.S5×105-106Glucose peptone55-6024,168Bacillus subtilis var. nigerB.SvN5×105-106LB35-3724Mycobacterium smegmatisM.S1×107?Middlebrook 7H935-3724Staphylococcus aureusS.A1×107?TSB35-3724

Pipet 100 μl bacterial suspension culture (OD450 nm=1.0) on rectangle filter paper (about 5 mm×10 mm, biological indicators ofMycobacteriumsmegmatis(MC2155)，Staphylococcusaureus(ATCC25923) are achieved; and then inoculate 100 μl bacterial suspension culture (OD450 nm=1.0) diluted by 10 times on culture media plates, and bacterial load on filter was about 107CFU by counting the bacterial colonies on the plates.

表2室溫甲醛蒸汽循環(huán)熏蒸消毒效果的評(píng)估

Tab.2Effectsofformaldehydesterilizationondifferentbiologicalindicators

Time (h)Location of biological indicators during formaldehyde sterilization of HEPA filter in situRight oppsite side of HEPA filter attached to exhaust boxB.SB.SvNM.SS.ALeft side of exhaust box behind HEPA filterB.SB.SvNM.SS.ATop side of exhaust box behind HEPA filterB.SB.SvNM.SS.ABottom of exhaust box behind HEPA filterB.SB.SvNM.SS.AInside of main area within BSL-3 laboratory?B.SB.SvNM.SS.AAutoclaves 121 ℃,15 min??B.SB.SvNM.SS.A2++--++--++--++--++++----12----------------++++----

“+” indicates growth of bacteria after incubation; “-” indicates no growth of bacteria after incubation; *, negative control, no sterilization; **, positive control, autoclaved by 121 ℃, 15 min.

甲醛蒸汽循環(huán)消毒作用12 h后，取出用于檢測(cè)HEPA過(guò)濾器原位消毒的菌片，培養(yǎng)24 h后，恥垢分枝桿菌與金黃色葡萄球菌的菌片均無(wú)細(xì)菌附著生長(zhǎng)，培養(yǎng)液澄清透明；嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片培養(yǎng)液為紫色澄清，未見(jiàn)菌片有附著生長(zhǎng)的細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)144 h，未見(jiàn)培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌黑色變種菌片培養(yǎng)液為淺黃色澄清，未見(jiàn)菌片有附著生長(zhǎng)的細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)144 h，未見(jiàn)培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)(表2)。HEPA過(guò)濾器經(jīng)甲醛蒸汽消毒滅菌后，對(duì)4個(gè)位置的菌片，每個(gè)位置每種菌片各取3個(gè)樣本進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，4個(gè)位置的培養(yǎng)結(jié)果一致，無(wú)明顯生長(zhǎng)差異(圖2)。同時(shí)對(duì)放置于HEPA過(guò)濾器排風(fēng)箱體內(nèi)側(cè)壁的正面、底面、頂面、側(cè)面的菌片，進(jìn)行平行培養(yǎng)，各組培養(yǎng)結(jié)果一致。

3 討論

新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求》(GB19489-2008)指出，BSL-3實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的送、排風(fēng)系統(tǒng)必須確保實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行時(shí)氣流由低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)向高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)流動(dòng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室的空氣只能通過(guò)HEPA過(guò)濾器過(guò)濾后才能排出[3]，因此實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作的高致病性病原微生物隨實(shí)驗(yàn)操作氣溶膠(約0.3 μm顆粒)化后隨定向氣流流動(dòng)，通過(guò)HEPA過(guò)濾器時(shí)被攔截于HEPA過(guò)濾器(對(duì)0.3 μm顆粒的過(guò)濾效率約99.99%)。在BSL-3實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行過(guò)程中，需定期更換HEPA過(guò)濾器。其一，可保證HEPA過(guò)濾器的前后阻力在可控制范圍，保證送、排風(fēng)系統(tǒng)聯(lián)動(dòng)機(jī)制的穩(wěn)定，提高BSL-3實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定。《實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求》2008版較2004版在通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)方面提出了更加嚴(yán)格的要求[3, 6]，兩者比較見(jiàn)表3。其二，BSL-3實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)的排風(fēng)HEPA過(guò)濾器存在被實(shí)驗(yàn)活動(dòng)所操作的高致病性病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此更換HEPA過(guò)濾器前，必須在原位對(duì)HEPA過(guò)濾器進(jìn)行徹底消毒，從而保證操作人員及BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境的生物安全。

圖2室溫甲醛蒸汽循環(huán)熏蒸12h后指示菌片培養(yǎng)

Fig.2CultureofbiologicalindicatorsforsterilizationofHEPAfilterinsituafter12-hourcontinuousformaldehydefumigationsterilizationatroomtemperature

表3不同氣體消毒方法的對(duì)比

Tab.3Comparisonofdifferentgassterilizationsforsporicidalefficiency*

Types of sterilization Gas concentration (mg/L)TemperatureExposure time (min)Main disadvantagesLTSF8-1660-80>120Potential carcinogenEOG450-1 200 37-6360-360Hazards to skin and nervous system, carcinogen HPGP637-4452-75Low penetration capabilities

*, 106reduction of spores; LTSF, low-temperature steam formaldehyde; EOG, ethylene oxide gas; HPGP, hydrogen peroxide gas plasma.

目前，BSL-3實(shí)驗(yàn)室空間消毒的方法主要有低溫甲醛蒸汽熏蒸消毒(low-temperature steam formaldehyde sterilization，LTSF)、環(huán)氧乙烷氣體消毒(ethylene oxide gas sterilization，EOG)、過(guò)氧化氫氣體消毒(hydrogen peroxide gas plasma sterilization，HPGP)。對(duì)比3種氣體消毒方法(表3)可以看出，HPGP優(yōu)于LTSF及EOG，但需專(zhuān)門(mén)的過(guò)氧化氫氣化設(shè)備，價(jià)格昂貴而不能普及；而EOG對(duì)皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及致癌能力較強(qiáng)。因此，本研究選擇甲醛作為消毒劑。甲醛通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)中的氨基、巰基基團(tuán)及嘌呤堿環(huán)中的氮原子烷基化殺滅微生物[7]。在北歐、德國(guó)、英國(guó)及發(fā)展中國(guó)家，低溫甲醛蒸汽熏蒸消毒廣泛應(yīng)用于不耐熱醫(yī)療器械及其附件的消毒：向密閉容器中間斷地注入水蒸氣與甲醛[8]，維持甲醛濃度在8～16mg/L、蒸汽溫度處于70～75 ℃，以達(dá)到消毒效果。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉，可用于殺滅植物細(xì)菌、分枝桿菌及抵抗力更強(qiáng)的萎縮芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌等[9,10]。

目前仍無(wú)確切研究證實(shí)甲醛蒸汽在室溫下消毒的效果[11]。BSL-3實(shí)驗(yàn)室核心區(qū)的排風(fēng)HEPA過(guò)濾器消毒在室溫下進(jìn)行，消毒氣體必須循環(huán)穿透HEPA過(guò)濾器才能達(dá)到徹底消毒的目的。本研究設(shè)計(jì)的甲醛蒸汽熏蒸消毒樣機(jī)對(duì)HEPA過(guò)濾器原位消毒的結(jié)果顯示，室溫條件下，甲醛蒸汽濃度為16 mg/L，相對(duì)濕度70%，維持循環(huán)消毒時(shí)間12 h，可有效殺滅105～106嗜熱脂肪芽胞桿菌及枯草芽胞桿菌，達(dá)到HEPA過(guò)濾器原位消毒的目的。

BSL-3實(shí)驗(yàn)室需監(jiān)測(cè)采用的消毒程序?qū)λ僮鞯牟≡⑸?或模式菌)的滅菌效果，如實(shí)驗(yàn)室從事病毒、真菌或其他高致病性病原微生物，則應(yīng)對(duì)相應(yīng)微生物的滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)(或采用滅菌抵抗性高于相應(yīng)微生物的指示菌(biological indicator)。本實(shí)驗(yàn)室所操作的病原微生物是結(jié)核分枝桿菌，所以選擇的細(xì)菌菌片指示劑既有恥垢分枝桿菌，又有抵抗性強(qiáng)的芽胞菌片，且常規(guī)滅菌效果監(jiān)測(cè)都是通過(guò)對(duì)芽胞菌片的殺滅來(lái)直接反映消毒方法的有效性?？莶菅堪麠U菌(106)是驗(yàn)證EOG效果的常用指示菌，嗜熱脂肪芽胞桿菌 (105) 常用于高壓蒸汽滅菌、過(guò)氧化氫氣體及過(guò)氧乙酸溶液滅菌效果的驗(yàn)證。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室從事的病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，選擇嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌作為消毒方法有效性驗(yàn)證的生物指示劑。結(jié)果顯示，室溫甲醛氣體消毒2 h能有效殺滅恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌，但對(duì)嗜熱脂肪芽胞桿菌及枯草芽胞桿菌無(wú)效。將甲醛氣體消毒循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，可有效殺滅所有的測(cè)試細(xì)菌，包括嗜熱脂肪芽胞桿菌及枯草芽胞桿菌。為了驗(yàn)證甲醛蒸汽循環(huán)消毒法對(duì)從事結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室排風(fēng)HEPA過(guò)濾器的消毒效果，本研究選擇恥垢分枝桿菌作為消毒效果的指示菌。結(jié)果顯示，甲醛蒸汽循環(huán)2 h即可有效殺滅恥垢分枝桿菌，為BSL-3實(shí)驗(yàn)室消毒、清場(chǎng)方法的建立及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了參考依據(jù)。本研究結(jié)果也提示：①不同BSL-3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所操作的高致病性病原微生物及進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，選擇相應(yīng)生物指示菌作為消毒效果的驗(yàn)證；②應(yīng)根據(jù)BSL-3實(shí)驗(yàn)室排風(fēng)HEPA過(guò)濾器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)消毒程序并進(jìn)行有效性驗(yàn)證；③消毒程序的有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)以簡(jiǎn)單、有效為原則，以保證有關(guān)工作的常態(tài)性，保障BSL-3實(shí)驗(yàn)室的生物安全。

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