潘力 王云艷 王斌 何攀 李俊星

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006)

黑曲霉(Aspergillus niger)是絲狀真菌中的重要類群，具有高效的蛋白表達、分泌和修飾能力，被美國食品及藥物管理局(FDA)認(rèn)定為安全菌株，在食品、醫(yī)藥、飼料、工業(yè)酶制劑等領(lǐng)域正受到越來越多的關(guān)注［1-4］.在基因工程中，外源基因進入黑曲霉細胞后會整合在其染色體上，重組子具有很高的遺傳穩(wěn)定性［5］，有利于異源基因的高效表達，因此黑曲霉作為異源蛋白的重組表達系統(tǒng)日益受到重視.黑曲霉作為表達系統(tǒng)的關(guān)鍵技術(shù)是遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(ATMT)具有操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點［6］，其效率遠高于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等傳統(tǒng)方法［7］，已成功應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化［8-11］.目前，ATMT介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化局限于基因功能研究［6］，鐘耀華［12］曾利用 ATMT 轉(zhuǎn)化瑞氏木霉分析其生長代謝突變子.然而，由于遺傳篩選標(biāo)記的限制，利用ATMT介導(dǎo)黑曲霉表達異源蛋白的研究鮮見報道.本研究以在輕工食品行業(yè)具有重要應(yīng)用的米黑根毛霉脂肪酶(RML)為研究對象，在優(yōu)化遺傳篩選標(biāo)記的基礎(chǔ)上，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)RML表達載體轉(zhuǎn)化無孢黑曲霉，并對轉(zhuǎn)化子表達RML進行初步的發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為RML的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

無孢黑曲霉SH-1，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室保藏;根癌農(nóng)桿菌LBA4404，由廣東省農(nóng)科院惠贈.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室構(gòu)建了3種根癌農(nóng)桿菌工程菌:LBA4404A含pHGW-PT表達載體、潮霉素(HygB)抗性基因、吡啶硫胺素(PT)抗性基因;LBA4404B含pHGW-amdS表達載體、HygB抗性基因、乙酰胺酶基因(amdS);LBA4404C含脂肪酶表達載體pHGWRML、HygB抗性基因、RML基因表達盒(3'端添加His6組氨酸標(biāo)簽)［13］.

1.2 培養(yǎng)基

根癌農(nóng)桿菌LC培養(yǎng)基、黑曲霉誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM培養(yǎng)基)、黑曲霉基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)、乙酰胺培養(yǎng)基參照文獻［8］配制.黑曲霉淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏3g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，淀粉10 g/L，NaCl 2g/L，瓊脂 1.7%，pH=5.5.YPD 培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L.察氏培養(yǎng)基(CD培養(yǎng)基):蔗糖 20 g/L，硝酸鈉 3 g/L，KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO41 g/L、FeSO40.01g/L，瓊脂粉 1.5%，pH=5.5.

1.3 試劑與儀器

HygB購自美國Merck公司;PT、乙酰丁香酮、牛血清白蛋白(BSA)、對硝基苯酚辛酸酯(pNPC)購自Sigma-Aldrich公司;三丁酸甘油酯購自百靈威公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純.主要儀器包括德國Eppendorf公司PCR儀，美國Thermo Scientific SORVALL高速冷凍離心機，美國Bio-RAD公司蛋白、核酸電泳儀，美國Pall公司純水儀，美國GE公司蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTATM purifier，瑞士TECAN公司Sunrise多功能酶標(biāo)儀等.

1.4 黑曲霉藥物敏感性試驗

制備100 μg/mL 潮霉素、0.1 μg/mL 吡啶硫胺素的水溶液.參照文獻［8］制備含0.01 mol/L乙酰胺的培養(yǎng)基.各取200μL黑曲霉菌種涂布分別加有100μg/mL HygB、0.1μg/mL PT的 CD 固體培養(yǎng)基.取200μL黑曲霉菌種涂布含有0.01 mol/L乙酰胺的固體培養(yǎng)基.各取200μL黑曲霉菌種涂布不加上述藥物的CD培養(yǎng)基平板，作為對照.30℃培養(yǎng)4天后觀察黑曲霉在藥物作用下的生長情況.

1.5 ATMT法介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系的建立

參照文獻［8］報道的轉(zhuǎn)化方法.將在淀粉培養(yǎng)基平板上活化后的黑曲霉單菌落轉(zhuǎn)移至CD液體培養(yǎng)基中34℃培養(yǎng)5天待用.將含有待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌在LC培養(yǎng)基平板(含20 μg/mL利福平和100μg/mL壯觀霉素)上活化，挑取較大的單菌落接種于LC液體培養(yǎng)基(含上述藥物)，28℃、250r/min培養(yǎng)24 h;取1.5 mL根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)液離心棄上清，加入5mL IM液體培養(yǎng)基(含5 μL 0.2 mol/L乙酰丁香酮)重懸菌體，28℃、100 r/min避光培養(yǎng)4～5h，待菌體D(600)值為1.0左右時取出待用.將100μL黑曲霉培養(yǎng)物與100 μL根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合均勻后涂布于含0.2 mmol/L乙酰丁香酮的IM培養(yǎng)基平板上，22.5℃避光培養(yǎng)3天;將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含0.2 mol/L頭孢噻肟和100 μg/mL潮霉素的MM培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)4～6天，待轉(zhuǎn)化子長出后提取基因組DNA進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定，所用引物見表1.

1.6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的脂肪酶RML轉(zhuǎn)化黑曲霉

1.6.1 脂肪酶表達載體pHGW-RML轉(zhuǎn)化黑曲霉

脂肪酶表達載體pHGW-RML轉(zhuǎn)化黑曲霉的方法參見1.5.篩選標(biāo)記為HygB抗性基因.

1.6.2 RML轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定和表觀酶活檢測

將在篩選平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子，用滅菌牙簽轉(zhuǎn)接至含0.5%(體積分?jǐn)?shù))三丁酸甘油酯的CD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3～5天，觀察轉(zhuǎn)化子周圍有無水解圈出現(xiàn).提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，對篩選標(biāo)記基因、RML基因進行PCR擴增，以鑒定RML表達載體是否已整合在黑曲霉基因組上，所用引物見表1.

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.6.3 RML轉(zhuǎn)化子蛋白的提取及鑒定

將在CD培養(yǎng)基(含0.08%瓊脂)中培養(yǎng)5～7天的黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子菌液經(jīng)離心濃縮后獲得RML轉(zhuǎn)化子種子培養(yǎng)液(D(600)值＞2.0).吸取2mL種子液接種50mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)3天，發(fā)酵液用四層擦鏡紙過濾除去培養(yǎng)基及菌絲，濾液離心得蛋白粗提液.蛋白粗提液經(jīng)超濾濃縮并測定濃度后備用.蛋白粗提液的親和層析純化參照鎳柱產(chǎn)品使用說明及分子克隆方法［14］進行，測定所得RML蛋白樣品的濃度，并采用10%分離膠進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測.

1.6.4 RML轉(zhuǎn)化子發(fā)酵條件的初步優(yōu)化及脂肪酶酶活測定

對轉(zhuǎn)化子表達脂肪酶的發(fā)酵優(yōu)化主要針對3個因素:碳源、溫度和pH.碳源選用葡萄糖，用量分別為2%、3%、4%和5%;培養(yǎng)溫度分別為30、33和36℃;pH 值選擇4.5、5.5 和 6.5.其它培養(yǎng)基成分與 YPD培養(yǎng)基相同，樣品于250r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5～8天.自第3天開始取樣測定脂肪酶活力，以確定合適的發(fā)酵培養(yǎng)條件.脂肪酶活力測定方法:將脂肪酶底物pNPC溶于水中，添加0.5%Triton作乳化劑，經(jīng)勻漿制備濃度為2.5mmol/L的底物溶液.將500 μL底物溶液、20 μL RML 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液和 480 μL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液混合，配制1 mL酶活反應(yīng)體系，于45℃預(yù)熱后反應(yīng)10 min，加入20 μL 5%三氯乙酸終止反應(yīng).取200μL反應(yīng)液至96孔板，用酶標(biāo)儀測定D(405)值.脂肪酶活力單位(U)定義為每分鐘水解底物pNPC生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量.

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉篩選標(biāo)記的確定

在含100μg/mL潮霉素的CD培養(yǎng)基平板上，黑曲霉SH-1的生長受到完全抑制，而在不加HygB的平板上黑曲霉生長旺盛(見圖1(a)、1(b))，說明黑曲霉對HygB敏感.同樣，0.1μg/mL的PT可以抑制黑曲霉在CD平板上的生長，而在不加PT的平板上黑曲霉生長正常(見圖1(a)、1(c)).因此HygB、PT的抗性基因可以作為黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記.在以乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基平板上，黑曲霉SH-1生長十分緩慢(見圖1(a)、1(d))，說明黑曲霉利用乙酰胺作為氮源的能力較弱.來源于構(gòu)巢曲霉的乙酰胺酶能有效分解乙酰胺提供氮源，而序列分析表明黑曲霉的乙酰胺酶基因(amdS)與構(gòu)巢曲霉amdS基因只有22.31%的同源性，導(dǎo)致黑曲霉利用乙酰胺的能力十分有限，這為黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個很好的篩選標(biāo)記.

圖1 黑曲霉SH-1對潮霉素B、吡啶硫胺素、乙酰胺的生長敏感性Fig.1 Growth sensitivity of A.niger SH-1 tohygromycin B，pyrithiamine and acetamide

2.2 以HygB抗性基因為篩選標(biāo)記的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

本研究以HygB抗性基因作為篩選標(biāo)記，利用ATMT法介導(dǎo)表達載體 pHGW-PT、pHGW-amdS轉(zhuǎn)化黑曲霉SH-1.在篩選平板上獲得4個具有HygB抗性的pHGW-PT轉(zhuǎn)化子(見圖2(a))，其在含PT的平板上生長旺盛，而宿主菌基本沒有生長(見圖2(b))，經(jīng)PCR擴增在轉(zhuǎn)化子中獲得了HygB、PT抗性基因的 PCR產(chǎn)物(見圖3(a)、3(b)).pHGW-amdS轉(zhuǎn)化宿主菌得到3個轉(zhuǎn)化子(見圖4(a))，其在乙酰胺培養(yǎng)基平板上生長旺盛而野生型宿主菌則生長較差(見圖4(b))，經(jīng)PCR擴增在轉(zhuǎn)化子中得到了HygB抗性基因和amdS基因的PCR產(chǎn)物(見圖5(a)、5(b)).以上結(jié)果表明，以HygB抗性基因作為篩選標(biāo)記可以有效地獲得轉(zhuǎn)化子，間接證明了PT抗性基因和amdS基因可以作為遺傳篩選標(biāo)記.由此建立了以HygB為篩選標(biāo)記的黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系.

圖2 黑曲霉SH-1的pHGW-PT表達載體轉(zhuǎn)化Fig.2 Transformation of A.niger SH-1 with pHGW-PT expression vector

圖3 pHGW-PT轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pHGW-PT transformants

2.3 黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子的鑒定

用pHGW-RML表達載體轉(zhuǎn)化黑曲霉后，在含頭孢噻肟和潮霉素的篩選平板上出現(xiàn)4個轉(zhuǎn)化子(見圖6(a))，將其轉(zhuǎn)移至含三丁酸甘油酯的CD培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)化子菌落周圍出現(xiàn)底物水解圈，而宿主菌則沒有水解圈(見圖6(b))，表明RML基因已在黑曲霉中表達.以所得轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，經(jīng)PCR獲得了HygB抗性基因、RML基因的PCR產(chǎn)物(見圖7(a)、7(b))，將擴增得到的RML基因的PCR產(chǎn)物(644 bp)進行測序，測序結(jié)果與RML基因原始序列完全一致，表明所得黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子是陽性克隆.由于所用宿主為不產(chǎn)孢子的無孢黑曲霉，有利于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的順利進行;實驗結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化效率較高.

圖4 黑曲霉SH-1的pHGW-amdS表達載體轉(zhuǎn)化Fig.4 Transformation of A.niger SH-1 with pHGW-amdS expression vector

圖5 pHGW-amdS轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of pHGW-amdS transformants

圖6 黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子的底物水解鑒定Fig.6 Hydrolyzing verification of A.niger transformants bearing RML gene

圖7 黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.7 PCR identification of A.niger RML transformants

2.4 RML蛋白的親和層析及SDS-PAGE鑒定

將活化的RML轉(zhuǎn)化子在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后收集發(fā)酵液上清，經(jīng)超濾濃縮后進行親和層析，洗脫峰非常明顯，說明帶有His6組氨酸標(biāo)簽的RML蛋白與鎳柱可以牢固結(jié)合并有效洗脫，純化效果較好(見圖8(a)).將純化后的RML蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，在相對分子質(zhì)量33000處出現(xiàn)了顯著的單一目的蛋白條帶，與RML蛋白的大小吻合［15］(見圖8(b))，因此本研究構(gòu)建的黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子成功表達了重組脂肪酶.

圖8 重組脂肪酶的親和層析純化及SDS-PAGE電泳鑒定Fig.8 Affinity chromatography of recombinant lipase and its verification by SDS-PAGE

2.5 黑曲霉RML轉(zhuǎn)化子發(fā)酵條件優(yōu)化

絲狀真菌的培養(yǎng)溫度一般是30℃.本研究選擇30、33和36℃ 3個溫度梯度進行試驗(pH=5.5，葡萄糖用量為2%)，培養(yǎng)時間設(shè)定為6天，結(jié)果表明30℃培養(yǎng)時黑曲霉發(fā)酵液脂肪酶酶活最高(3.3 U/mL)，因此選擇30℃作為最適的培養(yǎng)溫度.絲狀真菌生長pH 值一般選擇5.5，本研究選擇 4.5、5.5 和 6.5 進行試驗(培養(yǎng)溫度為30℃，葡萄糖用量為2%)，培養(yǎng)時間設(shè)定為6天，結(jié)果表明在pH=4.5時，發(fā)酵液的脂肪酶酶活最高(6.4 U/mL)，因此選擇pH=4.5為最佳pH值.

對于碳源(葡萄糖)用量的優(yōu)化，選擇2%、3%、4%和5%4個梯度配制YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度和pH按照上述優(yōu)化后的條件:30℃、pH=4.5.轉(zhuǎn)化子發(fā)酵培養(yǎng)至第7天時，葡萄糖用量為5%的發(fā)酵液的脂肪酶酶活達到最高(15 U/mL).在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，第4天時葡萄糖用量為2%的發(fā)酵液的酶活最高，第5天時葡萄糖用量為3%的發(fā)酵液的酶活最高，第6天時葡萄糖用量為4%的發(fā)酵液的酶活最高，而在第7天時葡萄糖用量為5%的發(fā)酵液的酶活達到最高.推測原因可能是初始葡萄糖濃度過高導(dǎo)致產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”即代謝物阻遏效應(yīng)，從而影響了基因的表達.因此，在轉(zhuǎn)化子發(fā)酵過程中維持培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在一個合適的水平，對于脂肪酶的高效表達十分重要.經(jīng)優(yōu)化，用對硝基苯酚比色法測定RML轉(zhuǎn)化子的酶活，其最高可以達到15U/mL，是其在酵母中表達水平(0.3 U/mL［16］、1.4U/mL［17］)的10倍以上.江慧芳等［18］研究表明脂肪酶酶活的測定方法不同會導(dǎo)致測定結(jié)果在數(shù)值上存在差異，本研究采用的對硝基苯酚比色法測定的脂肪酶酶活在數(shù)值上僅為橄欖油－堿滴定法的1%左右.徐蘇煒等［19］在畢赤酵母中表達RML基因，用橄欖油－堿滴定法測定的脂肪酶酶活為102U/mL;Brocca等［20］重組表達來源于皺褶假絲酵母的脂肪酶lip1，采用堿滴定法測定的酶活為150 U/mL;將其換算為對硝基苯酚比色法測定的酶活則只有1.02 U/mL和1.50U/mL，遠小于本研究獲得的重組黑曲霉的脂肪酶酶活，表明黑曲霉重組表達系統(tǒng)是非常有潛力的異源蛋白表達系統(tǒng).

3 結(jié)語

將植物基因工程的技術(shù)應(yīng)用于絲狀真菌，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系，對提高工業(yè)微生物育種效率作了有益的嘗試.利用該黑曲霉轉(zhuǎn)化體系表達脂肪酶RML，經(jīng)PCR鑒定、酶活檢測、鎳柱親和層析及SDS-PAGE電泳檢測等成功獲得了脂肪酶RML的黑曲霉轉(zhuǎn)化子，通過發(fā)酵條件優(yōu)化實現(xiàn)了RML的高效表達，轉(zhuǎn)化子的RML酶活是其在酵母中表達水平的10倍以上，為RML在油脂、食品、生物柴油、醫(yī)藥和日化等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為異源蛋白在黑曲霉中的高效表達提供了研究線索.在此基礎(chǔ)上，本研究將利用所獲得的脂肪酶開展油脂轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物柴油等工作，為重組脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用進行工藝探索.

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