文 進(jìn)，紀(jì)志剛，牛吉瑞

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

·論著·

環(huán)孢素A及他克莫司對(duì)移植腎受者Th免疫基因的調(diào)控

文 進(jìn)，紀(jì)志剛，牛吉瑞

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京 100730

目的觀察環(huán)孢素A (CsA)和他克莫司(FK506)分別作用后，移植腎受者Th基因的表達(dá)變化。方法分離移植腎受者在藥物作用前后24 h的外周血淋巴細(xì)胞，將其總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄并行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，使用生物信息學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào)，IL-2、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IL15、IRF4、TFCP2基因顯著下調(diào)。FK506作用24h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào)，CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調(diào)。結(jié)論CsA 及FK506可能通過調(diào)控以上輔助性T淋巴細(xì)胞免疫基因發(fā)揮藥理作用。

基因表達(dá)調(diào)控；腎移植；基因芯片；環(huán)孢素A；他克莫司

ActaAcadMedSin，2012,34(6)：563-566

環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)和他克莫司(tacrolimus, FK506)是同種異體腎移植術(shù)后主要的免疫抑制治療藥物，同屬鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurine inhibitor，CNI)類藥物，但其在免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)、用藥劑量和不良反應(yīng)等方面卻各具特點(diǎn)。本研究采用功能分類基因芯片，觀察了CsA和FK506對(duì)移植腎受者輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)免疫基因的影響，以期從中篩選出差異表達(dá)基因進(jìn)行功能研究，從而揭示二者作用靶基因，為臨床有效用藥提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

標(biāo)本來源隨機(jī)選取2011至2012年在北京協(xié)和醫(yī)院接受同種異體腎移植術(shù)的志愿者4名(手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后48 h內(nèi)外周血白細(xì)胞數(shù)正常，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)日變化量不超過CBC-3DL血液自動(dòng)分析儀允許誤差范圍，4×108/L)，每人在CsA和FK506治療前及治療后24 h各提供10 ml全血，經(jīng)分離、純化可得107個(gè)淋巴細(xì)胞。

主要儀器和試劑淋巴細(xì)胞分離液購于上海試劑二廠，RNA抽提試劑Trizol購自美國GIBCO公司，免疫基因芯片“Human Th1-Th2-Th3”為上?？党缮镉邢薰井a(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)使用的CNI不同, 分為CsA組和FK506組，即CsA和FK506作用24 h時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)組，藥物治療前外周血淋巴細(xì)胞作對(duì)照組。CsA用量為6 mg/(kg·d)，F(xiàn)K506用量為0.1 mg/(kg·d)。

淋巴細(xì)胞分離采集EDTA抗凝外周全血標(biāo)本，在無菌條件下采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞；取外周血，肝素抗凝，全血2000 r/min離心10 min；吸白膜，加入適量1%甲基纖維素除血小板，少許羰基鐵粉祛除單核細(xì)胞，充分混勻。室溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)25 min，立30 min。取上清緩慢轉(zhuǎn)入另一已加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，并使上述混合液處于淋巴細(xì)胞分離液液面之上，保留清晰的界面，2000 r/min離心30 min；用移液槍小心分離出淋巴細(xì)胞層；用已除RNA酶的PBS清洗細(xì)胞。先后以2000 r/min 10 min，1200 r/min 6 min，800 r/min 6 min離心回收細(xì)胞，棄去上清。

總RNA抽提采用一步法抽提總RNA。每10 ml全血分離出的淋巴細(xì)胞加入2 ml的Trizol試劑，用一次性注射器進(jìn)行反復(fù)抽打細(xì)胞直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，使之充分溶解于Trizol中形成清亮不黏稠的液體；加0.4ml氯仿分離RNA，1 ml異丙醇沉RNA，2 ml 75%乙醇洗滌，Rnase-free 的水溶解RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值及濃度。RNA樣本的OD260/OD280應(yīng)在1.7～2.2之間，總RNA電泳圖譜有清晰的28 S 、18 S條帶且28S=2×18S為合格樣品。 -70℃凍存。

實(shí)時(shí)定量PCR聚合酶激活/變性，95℃，10 min；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95℃，15 s；60℃，1 min，收集熒光。陽性結(jié)果判斷：挑選差異表達(dá)的探針函數(shù)返回一個(gè)PC類的對(duì)象，包括兩部分fc和tt，fc是log2 fold change，而tt是t檢驗(yàn)的P值。Log2(FC)>2或<-2為差異表達(dá)基因。

結(jié) 果

CsA作用組差異表達(dá)基因CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào)，IL-2、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IL15、IRF4、TFCP2基因顯著下調(diào)。

FK506作用組差異表達(dá)基因FK506作用24 h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào), IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、 CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調(diào)。

討 論

機(jī)體對(duì)移植腎的免疫應(yīng)答主要包括以下幾個(gè)過程：(1)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)移植腎人類白細(xì)胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)的識(shí)別和提取。(2)共刺激信號(hào)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的活化，包括：早期跨膜信息的傳遞；各種早反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄性活化；新的淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)；T、B淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)，分化出各種效應(yīng)細(xì)胞通過各種途徑攻擊移植腎，引起各種類型排斥反應(yīng)[1]。研究表明, CD4+Th1細(xì)胞主要參與急性排斥反應(yīng)，CD4+Th2細(xì)胞則主要參與慢性排斥反應(yīng)，而CD8+T細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)中除具有攻擊殺傷的細(xì)胞毒作用外，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。迄今為止，抑制移植排斥反應(yīng)的最好辦法仍是應(yīng)用免疫抑制劑。腎臟移植外科手術(shù)以后，免疫抑制應(yīng)用及調(diào)控至關(guān)重要，不同的免疫抑制劑應(yīng)用方案及免疫調(diào)控手段，可能使腎臟移植受者出現(xiàn)不同的結(jié)局。目前采用以CsA和Fk506為基礎(chǔ)的免疫抑制治療方案[2-3]。

蛋白水平研究表明，CsA是一種CNI，通過與T細(xì)胞胞漿內(nèi)的CsA受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化與增殖，產(chǎn)生免疫抑制。CsA的臨床應(yīng)用使器官移植存活率上升到80%～90%。FK506也是一種CNI，主要作用于T細(xì)胞，但免疫抑制作用為CsA的10～100倍。FK506進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)首先與FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding protein，F(xiàn)KBP)結(jié)合成復(fù)合體，該復(fù)合體抑制神經(jīng)鈣調(diào)磷酸酶，阻止了T細(xì)胞核中的活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)[4-5]。 隨著分子免疫學(xué)研究的飛速發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到機(jī)體針對(duì)移植腎的免疫應(yīng)答嚴(yán)格受各種基因控制。免疫抑制藥物通過對(duì)各條免疫應(yīng)答途徑涉及的一系列基因調(diào)控，實(shí)現(xiàn)其藥理作用。

本研究采用輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)基因芯片分析CsA和FK506對(duì)移植腎受者Th免疫基因的影響，從中篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)而了解這兩種常用的CNI免疫調(diào)節(jié)作用的異同,以求正確評(píng)估兩藥在抗排斥反應(yīng)的差別，為患者預(yù)防排斥反應(yīng)及為腎移植術(shù)后制訂更加合理的免疫抑制方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該芯片是一種功能分類基因芯片，所有入選基因幾乎都與某一明確的信號(hào)通路直接相關(guān)， 并且通常都可以找到論證其入選資格的科學(xué)文獻(xiàn)。本研究通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用幾個(gè)功能分類芯片便可以達(dá)到使用高通量表達(dá)譜芯片的同樣目的，從而達(dá)到事半功倍的效果。功能分類基因芯片采用了預(yù)先經(jīng)過科學(xué)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)和知識(shí)為基礎(chǔ)，這對(duì)于研究的準(zhǔn)確可靠性是十分有益的。因此，可以把功能分類基因芯片的結(jié)果比作對(duì)基因圖譜進(jìn)行局部放大的分子圖像。通過這一技術(shù)，基因技術(shù)革命或許會(huì)在生物醫(yī)藥和臨床診治研究中發(fā)揮更大的做用[6-7]。利用功能分類基因芯片以上特性可在藥物和基因之間架起一座橋梁，能從基因水平解釋藥物的作用機(jī)制，不僅能為藥物的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，還能為藥物的進(jìn)一步開發(fā)和設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。應(yīng)用基因芯片可以平行測(cè)定幾千個(gè)基因的表達(dá)變化，因而可以用來尋找有意義的藥物作用靶標(biāo)，監(jiān)測(cè)藥物治療過程中基因表達(dá)的變化，還可以直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物作用的靶點(diǎn)[8]，有助于快速、準(zhǔn)確地鑒別和確認(rèn)藥物靶標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，CsA和FK506能通過調(diào)控一系列基因，發(fā)揮有效的免疫抑制作用。CsA作用24 h后，Th家族中的TLR4、CEBPB、IL4R、IL1R1、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào)，IL-2、IL15、CCL5、CD27、CCR5、CCR4、CD4、RPL13A、TGFB3、CD86、CCR3、STAT1、NFATC2IP、IL23A、IRF4、TFCP2基因顯著下調(diào)。FK506作用24 h后，IL18、IL7、PTPRC、TNFSF4、SPP1、GFI1、TLR4、IL13RA1、TNF、INHBA、LAG3、IL13、IL1R1、SOCS5、IL10、YY1、TBX21、FASLG、IL18R1、IL1R2基因顯著上調(diào)，IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、CCR5、CD4、CD27、CD40LG、IL15、CCR3、CD86、CCR4、IRF4基因顯著下調(diào)。這表明盡管CsA和FK506免疫調(diào)節(jié)作用靶點(diǎn)存在差異，但二者均能不同程度抑制輔助性T淋巴細(xì)胞IL-2、IL15、CCR3、CCR4、CCR5、CD4 、CD86、IRF4的表達(dá)，進(jìn)而特異性抑制機(jī)體對(duì)移植腎的免疫應(yīng)答。

對(duì)不同免疫抑制劑作用靶點(diǎn)的研究，將有助于進(jìn)一步了解各種免疫抑制劑對(duì)T細(xì)胞活化和效應(yīng)調(diào)節(jié)特點(diǎn)，掌握其對(duì)T細(xì)胞免疫耐受的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)效應(yīng)。本研究盡管只提示了CsA和FK506的部分藥理作用，但為臨床深入研究免疫抑制劑的分子藥理作用提供了一個(gè)理想模式。在特異性免疫耐受的誘導(dǎo)尚未成功之前，免疫抑制劑仍是腎移植不可替代的治療手段。合理搭配現(xiàn)有免疫抑制藥物，制訂個(gè)體化的免疫抑制方案，并探索從單純免疫抑制到免疫調(diào)節(jié)的綜合治療措施，仍是一個(gè)有效途徑。

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Regulatory Effects of Cyclosporin A and Tacrolimus on Th Immunological Gene Expressions in Renal Transplant Recipients

WEN Jin, JI Zhi-gang, NIU Ji-rui

Department of Urology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

JI Zhi-gang Tel: 010-69156073，E-mail：wjjxmc@163.com

Objective To observe the change of Th immunological gene in renal transplant recipients after the treatment of cyclosporine(CsA) and tacrolimus (FK506).MethodsThe peripheral blood lymphacytes just before and 24 hours after CsA and FK506 treatment were isolated. The total RNA of them were reverse-transcripted and examined by real-time quantity PCR array. The results were analyzed by bioinformatic methods.ResultsThe TLR4, CEBPB, IL4R, IL1R1,IL18R1,and IL1R2 genes were remarkably upregulated, whereas IL-2, CCL5, CD27, CCR5, CCR4, CD4, RPL13A, TGFB3, CD86, CCR3, STAT1, NFATC2IP, IL23A, IL15, IRF4, and TFCP2 were downregulated 24 hours after CsA treatment. The IL18, IL7, PTPRC, TNFSF4, SPP1, GFI1, TLR4, IL13RA1, TNF, INHBA, LAG3, IL13, IL1R1, SOCS5, IL10, YY1, TBX21, FASLG, IL18R1, and IL1R2 genes were remarkably upregulated, whereas IL-2, IL-3, IL-4, IL-6,CCR5, CD4, CD27, CD40LG, IL15, CCR3, CD86, CCR4, and IRF4 were obviously downregulated 24 hours after FK506 treatment .ConclusionCsA and FK506 exert their therapeutic effectiveness by regulating the expressions of a series of target genes.

gene expression regulation; renal transplantation; genechip; cyclosporine; tacrolimus

紀(jì)志剛 電話：010-69156073, 電子郵件：wjjxmc@163.com

R392.4

A

1000-503X(2012)06-0563-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.06.005

衛(wèi)生部國際交流與合作中心合作項(xiàng)目基金(IHBCC07-201004)Supported by the Foundation of International Health Exchange and Cooperation Center, Ministry of Health(IHBCC07-201004)

2012-02-15)