陳晉廣，賴 維，姜 昱

1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣州 510630

2浙江省臺州市立醫(yī)院皮膚科，浙江 臺州 318000

3廣東省中山市人民醫(yī)院皮膚科，廣東 中山 528403

銀屑病性關(guān)節(jié)炎 (psoriasis arthritis，PsA)的確切病因及發(fā)病機制至今仍未明了，目前研究認(rèn)為該病與免疫功能紊亂、內(nèi)分泌障礙、代謝障礙、遺傳、感染及外界刺激等多種因素有關(guān)。以往研究證實，效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞在銀屑病發(fā)病過程中起著重要作用。Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞為一種不同于Th1和Th2的新型CD4+T細(xì)胞亞群，兩者比例失衡在多種炎性關(guān)節(jié)病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1］。本研究檢測了PsA患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群及其分泌的白細(xì)胞介素 (interleukin，LI)-17、血清人轉(zhuǎn)化生長因子 (transfroming growth factor，TGF)-β1水平，觀察了Th17/Treg的變化，探討了其與PsA發(fā)病的關(guān)系。

對象和方法

對象 2008年1月至2011年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院、臺州市立醫(yī)院、中山市人民醫(yī)院三家單位風(fēng)濕免疫科和皮膚科就診的PsA患者35例，其中，男18例，女17例，平均年齡 (65.0±1.5)歲，病程0.5～17年。排除標(biāo)準(zhǔn):患者近2周內(nèi)接受過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等相關(guān)藥物治療;伴有心腦血管、肝、腎、內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)性疾病。正常對照組30人來自門診健康體檢人員，其中，男16人，女14人，平均年齡 (63.0±1.0)歲，均無風(fēng)濕病及其他自身免疫病病史。兩組在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＞0.05)。本研究經(jīng)中山市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

IL-17和TGF-β1檢測 受試者于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，離心后取血清，采用 ELISA試劑盒(美國Biosource公司)檢測血清中IL-17、TGF-β1含量，具體步驟按照說明書進行，在波長為450 nm下用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值，以空白孔均值調(diào)零。以5個標(biāo)準(zhǔn)物OD值 (復(fù)孔的均值)為Y軸，以各標(biāo)準(zhǔn)物濃度的自然對數(shù)值為X軸做曲線。

細(xì)胞培養(yǎng) 采集肝素鈉抗凝全血，RPMI1640培養(yǎng)液按1∶1稀釋后加入PMA(終濃度50μg/L)、離子霉素 (終濃度1 mg/L)和莫能霉 (1 mL/L)混勻，在37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，用于Th17細(xì)胞檢測。

T細(xì)胞亞群分析 取未刺激的肝素鈉抗凝全血50 μl，加入 10 μl Percp-抗 CD3/FITC-抗 CD4/PE-抗CD8三聯(lián)mAb，同型對照加入10 μl Percp-鼠 IgG1/F ITC-鼠IgG1/PE-鼠IgG1三聯(lián)抗體，于4℃下避光孵育30 min后加入2 ml NH4Cl溶血劑溶血，PBS洗滌重懸后用FACSCanto檢測，采用BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。

Th17細(xì)胞檢測 取培養(yǎng)后全血50 μl，加入10 μl PerCp-抗 CD3mAb 和 10 μl FITC-抗 CD4 mAb，于 4℃避光孵育30 min后，加NH4Cl溶血劑2 ml離心。棄上清，加入1 ml Fixation/Permeabilization穿膜45 min。用洗液洗滌后，加入10 μl PE-抗人IL-17A mAb(或加入10 μL PE-鼠 IgG1作為同型對照)，于4℃避光孵育30 min對胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17A進行染色，最后經(jīng)洗液洗滌后，以300 μl PBS重懸細(xì)胞。染色固定后的標(biāo)本用FACSCanto檢測，并采用BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。以CD4+T細(xì)胞設(shè)門，讀取CD4+IL-17+T細(xì)胞在CD3+CD4+T細(xì)胞中的比率。

Foxp3+CD4+CD25+Treg檢測 取未經(jīng)刺激培養(yǎng)的肝素鈉抗凝全血50 μl加入10 μl FITC-抗 CD4/APC-抗CD25二聯(lián)抗體，4℃下避光孵育30 min以標(biāo)記CD4+CD25+T細(xì)胞。經(jīng)溶血洗滌后，使用1 ml Fixation/Perm穿膜45 min。用洗液洗滌后，加入1 μl正常鼠血清于4℃封閉15 min后，加入10 μl PE-抗人Foxp3mAb(或加入 10 μl PE-鼠 IgG2b作為同型對照)，4℃孵育30 min，洗滌后用300 μl染色緩沖液重懸，F(xiàn)ACSCanto檢測BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞在CD3+CD4+T細(xì)胞中的比率進行統(tǒng)計。

觀察指標(biāo) 皮損評價根據(jù)銀屑病面積和嚴(yán)重度指數(shù) (psoriasis area and severity index，PASI)評分標(biāo)準(zhǔn)評價。關(guān)節(jié)炎評價采用文獻 ［2］方法進行:壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù) (0=無壓痛;1=輕度，觸壓關(guān)節(jié)時詢問患者稱有壓痛;2=中度，觸壓關(guān)節(jié)時患者主動訴其疼痛;3=重度，觸壓關(guān)節(jié)時患者會回避或退縮)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)指數(shù) (0=無腫脹;1=軟組織腫脹，但可見骨性標(biāo)志;2=腫脹，看不見骨性標(biāo)志或有關(guān)節(jié)積液)。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間Th17與Treg細(xì)胞數(shù)量比較采用 Mann-Whitney檢驗，IL-17、TGF-β1水平比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組Th17與Treg細(xì)胞數(shù)量的比較 PsA患者的Th17和外周血Th17/Treg分別為 (15.38±1.71)%和3.02±0.46，明顯高于對照組的 (8.41±1.38)%(u=3.56，P=0.0012)和 1.79±0.18(u=4.13，P=0.0042);Treg與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ［(6.07±1.23)%比 (5.87±1.19)%(u=0.92，P=0.26)］。

兩組IL-17、TGF-β1水平的比較 PsA患者血清IL-17水平為 (420.54±152.09)ng/L，明顯高于對照組的 (251.59±119.43)ng/L(t=3.24，P=0.0067);TGF-β1水平為 (179.35±98.15)ng/L，明顯低于對照組的 (230.98±110.13)ng/L(t=4.35，P=0.0052)。

IL-17、TGF-β1表達水平與PASI、關(guān)節(jié)炎評分的相關(guān)性分析結(jié)果 患者IL-17表達水平與PASI(r=0.539，P=0.002)、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù) (r=0.422，P=0.006)及腫脹關(guān)節(jié)數(shù) (r=0.207，P=0.043)均呈正相關(guān)，與壓痛關(guān)節(jié)數(shù) (r=0.312，P=0.061)和腫脹關(guān)節(jié)指數(shù) (r=0.332，P=0.061)無明顯相關(guān)性;TGF-β1水平與患者壓痛關(guān)節(jié)指數(shù) (r=－0.504，P=0.003)及腫脹關(guān)節(jié)指數(shù) (r=－0.403，P=0.002)均呈負(fù)相關(guān)，與壓痛關(guān)節(jié)數(shù) (r=－0.202，P=0.058)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù) (r=－0.373，P=0.131)和PASI(r=－0.311，P=0.211)無明顯相關(guān)性。

討 論

Th17和Treg是CD4+T細(xì)胞的兩個新亞型，二者在維持機體正常免疫應(yīng)答、防止自身免疫性疾病的產(chǎn)生具有重要意義。Th17細(xì)胞在中性粒細(xì)胞的動員、募集和活化，介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，在自身免疫性疾病、感染性疾病以及多種腫瘤的發(fā)病中可發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞的免疫抑制作用在分化過程中以及功能上與Th17細(xì)胞相互對抗，起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。Th17/Treg是兩種不同于Th1及Th2的新型免疫細(xì)胞，隨著對兩者研究的深入，越來越多證據(jù)顯示其在多種自身免疫性疾病發(fā)病中起著重要作用。Th17作為效應(yīng)性T細(xì)胞以分泌IL-17為主要特征，在介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用［3］。Treg細(xì)胞是維持機體免疫耐受的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，能選擇性抑制一些效應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，主要通過細(xì)胞接觸機制或抑制性細(xì)胞因子TGF-β1發(fā)揮主動免疫抑制作用［4］。

本研究結(jié)果顯示，PsA患者外周血血清中Th17細(xì)胞顯著高于對照組，Treg與對照組比較無顯著差異，推測Th17細(xì)胞高表達可能會產(chǎn)生高劑量IL-17;同時因患者TGF-β1水平低下，不能有效誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，患者Treg不能伴隨Th17細(xì)胞升高而上升，導(dǎo)致Th17/Treg升高現(xiàn)象。IL-17可刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，PGE2又可刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生破骨細(xì)胞分化因子 (osteoclast differentiation factor，ODF)，后者與其受體結(jié)合后可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa-binding，NF-κB)，又稱為 NF-κB 的受體激活劑(NF-κB receptor activator，RANK)，ODF為其配體，故ODF又命名為RANKL。RANKL與破骨細(xì)胞前體上的RANK結(jié)合，促進成熟破骨細(xì)胞的形成與活化。Th17本身表達RANKL，可與破骨細(xì)胞前體上的RANK結(jié)合，導(dǎo)致破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞［5］。可見，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17可能均參與了PsA炎癥病變及骨質(zhì)破壞的發(fā)病過程。TGF-β1是骨髓成骨祖細(xì)胞分化、增殖中的關(guān)鍵內(nèi)分泌生長因子，在骨形成以及骨關(guān)節(jié)修復(fù)過程中起著重要作用，其含量降低或者活性下降均可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PsA組患者的TGF-β1水平明顯低于對照組，與楊雁等［6］的研究結(jié)果類似，提示TGF-β1可能參與可PsA關(guān)節(jié)損害的發(fā)病過程。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，IL-17水平與PASI、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù)以及腫脹關(guān)節(jié)數(shù)均呈正相關(guān)，TGF-β1水平與患者壓痛關(guān)節(jié)指數(shù)及腫脹關(guān)節(jié)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，提示IL-17和TGF-β1水平變化對患者病情判斷有一定輔助診斷價值。

［1］賈捷婷，李慧，李國青，等.Th17/Treg細(xì)胞在炎性關(guān)節(jié)病的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2011，5(3):233-237.

［2］楊艷麗，張莉蕓，李小峰，等.重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白聯(lián)合甲氨蝶呤短期治療銀屑病關(guān)節(jié)炎15例臨床觀察［J］.中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2009，3(3):190-193.

［3］Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleuk in 17-producing CD4+effector T cel ls develop via a lineage distinct from the T helper 1 and 2 lineages ［J］.Nat Immunol，2005，6(11):1123-1132.

［4］馮寧翰，吳宏飛，吳軍，等.CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞作用機制的實驗研究 ［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(英文版)，2004，18(4):178-182.

［5］Sato K，Suematsu A，Okamoto K，et al.Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction ［J］.J Exp Med，2006，203(12):2673-2682.

［6］楊雁，楊靜，段西凌，等.銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1的檢測 ［J］.中華皮膚科雜志，2011，44(7):513-514.