李世章，金 英，楊 成，隋海娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

阿爾采末病(AD)是一種慢性原發(fā)、進(jìn)行性腦變性病，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有研究表明，AD患者認(rèn)知功能下降與突觸素(SYP)的丟失存在相關(guān)性。另有研究表明，神經(jīng)生長因子(NGF)可促進(jìn)海馬內(nèi)突觸的重建來提高SYP的表達(dá)從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［1］。NGF必須與其特異性高親和力受體酪氨酸激酶受體A(TrkA)結(jié)合才能發(fā)揮作用，當(dāng)TrkA受體的膜外部位點(diǎn)與NGF結(jié)合后形成TrkA二聚體，自身膜內(nèi)部酪氨酸殘基磷酸化，通過PI3K-Akt途徑，最終啟動(dòng)即早基因和延遲反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［2］。

阿魏酸是傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸和川芎的有效單體成分，具有抗氧化、抗自由基、抗感染及拮抗NO生成等藥理作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸納(sodium ferulate，SF)可減輕大鼠海馬錐體神經(jīng)元的損傷，對(duì)抗淀粉樣 β-蛋白引起的大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙［3］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察阿魏酸鈉對(duì)海馬區(qū)SYP、TrkA、磷酸化PDK1、磷酸化Akt蛋白表達(dá)的影響，以探討該藥改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及給藥方法 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，老年大鼠(500～600 g，18月)45只，隨機(jī)分為3組:生理鹽水對(duì)照組(每天灌胃給等量生理鹽水);SF 100、200 mg·kg－1劑量組(SF用生理鹽水溶解，灌胃量均為1.0 ml，現(xiàn)配現(xiàn)用);青年大鼠(250～350 g，3月)對(duì)照組15只(每天灌胃給等量生理鹽水)。灌胃時(shí)間均為2月。

1.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照Morris［4］方法實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠尋找平臺(tái)并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)和計(jì)算大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比，以觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改變。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)頸總動(dòng)脈持續(xù)灌注生理鹽水50 ml，然后再灌注4%多聚甲醛50 ml，取腦組織進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)進(jìn)行冠狀切片(厚度為5 μm)，每4張取1張，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察海馬SYP及TrkA表達(dá)的改變。免疫組織化學(xué)染色操作步驟SABC免疫組化染色試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.4 Western blot檢測(cè)SYP、磷酸化PDK1、磷酸化 Akt蛋白表達(dá)水平 取大鼠海馬的CA3區(qū)，提取總蛋白，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，分別加一抗(一抗為1∶1 000稀釋)4℃過夜，二抗(1∶1 000稀釋)，放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進(jìn)行ECl化學(xué)發(fā)光，測(cè)定SYP、p-PDK1、p-Akt473。每個(gè)抗體測(cè)定時(shí)都進(jìn)行β-肌動(dòng)蛋白測(cè)定，以保證蛋白上樣量的一致性，利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對(duì)蛋白帶進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SF對(duì)老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響 灌胃給藥2月后，SF 100、200 mg·kg－1組老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，表現(xiàn)為逃避潛伏期較對(duì)照組的老年大鼠明顯縮短，在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比明顯升高。

2.2 SF對(duì)老年大鼠海馬SYP蛋白表達(dá)的影響 老年對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回(DG)區(qū)SYP表達(dá)很少，應(yīng)用SF 200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)SYP表達(dá)均明顯增加，但CA3增加最明顯。SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)片狀或顆粒狀，分布密集，主要分布在神經(jīng)氈內(nèi)，有些顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍。

正常老年組大鼠海馬CA3區(qū)SYP的表達(dá)水平明顯降低。給予SF(100，200 mg·kg－1)可使老年大鼠海馬CA3區(qū)SYP的表達(dá)水平明顯增加。

2.3 SF對(duì)老年大鼠海馬神經(jīng)元TrkA表達(dá)水平的影響老年對(duì)照組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)TrkA表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)較少，SF 200 mg·kg－1組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)TrkA陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯增加，著色加深，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈棕黃色聚集。

2.4 SF對(duì)老年大鼠海馬CA3區(qū)p-PDK1及p-Akt表達(dá)的影響 正常老年大鼠海馬CA3區(qū)p-PDK1及p-Akt表達(dá)水平較青年對(duì)照組明顯降低，SF(100、200 mg·kg－1)組能明顯增加p-PDK1及p-Akt的蛋白表達(dá)水平。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察了阿魏酸鈉對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制，研究結(jié)果顯示SF可使老年大鼠海馬SYP及TrkA表達(dá)明顯增加，海馬CA3區(qū)p-PDK1和p-Akt的表達(dá)水平明顯增加。這些結(jié)果表明SF能夠改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與上調(diào)SYP、TrkA、p-PDK1和p-Akt的表達(dá)有關(guān)。

［1］ 洪樂鵬，龍大宏，冷水龍.Neurturin和NGF促進(jìn)AD鼠學(xué)習(xí)記憶恢復(fù)及海馬突觸素表達(dá)［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2004，13(2):134－5.

［1］ Hong L P，Long D H，Leng S L.Neurturin and NGF improve the ability of learning and memory and expression of synaptophysin in hippocampus of rats with fimbria-fornix transection［J］.Chin J Behavioral Med Sci，2004，13(2):134 －5.

［2］ 鄭麗君，楊 杰.TrkA受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及在腦缺血損害中的研究進(jìn)展［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2008，25(4):501 －3.

［2］ Zheng L J，Yang J.The research of TrkA receptor signal transduction pathway in ischemic brain damage［J］.J Apopl Nerv Dis，2008，25(4):501 －3.

［3］ 金 英，閆恩志，范 瑩，等.阿魏酸鈉對(duì)抗Aβ25-35致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙與IL-1β和p38MAPK表達(dá)的相關(guān)性探討［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(5):602 －6.

［3］ Jin Y，Yan E Z，F(xiàn)an Y，et al.Effects of sodium ferulate on Aβ25-35-induced cognitive deficits and expression of IL-1β and p38MAPK in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(5):602 －6.

［4］ Morris R.Development of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11(1):47－ 60.