陳興娟，張熙東，張璇，杲海霞，張海林

(河北醫(yī)科大學藥理學研究室，河北石家莊050017)

蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之間相互調(diào)節(jié)作用的研究進展

陳興娟，張熙東，張璇，杲海霞，張海林

(河北醫(yī)科大學藥理學研究室，河北石家莊050017)

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一個多基因家族，包含多種同工酶，分布廣泛且功能復雜，在許多信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2)是分布在細胞膜中的磷脂類信號分子，在細胞中的分布和含量處于動態(tài)變化中。PIP2的水解后生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的濃度從而改變鈣依賴型PKCs的活性。同時，PKC通過激活PI4K或PIP5K可以調(diào)節(jié)細胞膜PIP2水平。PKCs使離子通道蛋白發(fā)生磷酸化，改變通道蛋白與PIP2的親和力，從而影響PIP2對離子通道的調(diào)節(jié)。該文對PKCs和PIP2在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中相互調(diào)節(jié)的相關(guān)研究進展進行綜述。

蛋白激酶C;磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2);鈣離子;磷脂酶C(PLC);信號轉(zhuǎn)導;調(diào)節(jié)

磷脂酰肌醇4，5二磷酸［phosphatidylinositol(4，5)bisphosphate，PI(4，5)P2，簡稱IP2］屬于膜磷脂類，對許多細胞生理活動有調(diào)節(jié)作用。最初人們認為PIP2的作用主要是作為細胞中重要的第二信使三磷酸肌醇［insoitiol 1，4，5 trisphosphate，Ins(1，4，5)P3，簡稱IP3］和甘油二酯(diaceylglycerol，DAG)的前體。近年大量研究證據(jù)表明PIP2本身也是一種重要的第二信使。PIP2自身和許多細胞內(nèi)信號物質(zhì)有相互作用，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約有100多種蛋白質(zhì)與PIP2可能有相互作用。因此直接影響細胞膜PIP2水平變化的磷脂酰肌醇的代謝也成為研究者關(guān)注的焦點之一。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一個多基因家族，包含多種同工酶，分布廣泛且功能復雜。PKCs通過使底物發(fā)生絲氨酸或蘇氨酸磷酸化調(diào)節(jié)底物的生物活性進而參與不同的信號通路，其中PIP2合成過程中的重要激酶PI4K和PIP5K(PI4K使PI肌醇環(huán)四位發(fā)生磷酸化生成PIP，后者進一步在PIP5K的催化作用下五位發(fā)生磷酸化，最終生成信號分子PIP2)都可能就是PKCs的底物。PKC通過激活PI4K或PIP5K調(diào)節(jié)PIP2細胞膜水平。同時，G蛋白偶聯(lián)受體和生長因子類受體在受到細胞外信號分子的刺激后可以激活PLC，水解PIP2生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的濃度從而改變鈣依賴型PKCs的活性。此外，PKCs使對PIP2敏感的離子通道發(fā)生磷酸化，改變了通道蛋白與PIP2的親和力從而影響PIP2對離子通道的調(diào)節(jié)。PKCs和PIP2既獨立參與細胞信號傳導又相互影響相互調(diào)節(jié)。

本文就近年P(guān)KCs對PIP2在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中相互調(diào)節(jié)的研究進展作一綜述。

1 PIP2調(diào)節(jié)PKCs活性

細胞外信號如激素、生長因子類和機械刺激等激活G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶受體(RTKsR)，刺激信號傳入細胞后，活化PLC水解PI(4，5)P2，生成IP3和DAG。這是我們熟知的過程，根據(jù)PKC的激活特性可知，這一過程中的三個信號分子對不同亞型PKCs的活化都有調(diào)節(jié)作用。

Lai CL實驗室通過分子對接模擬試驗證明傳統(tǒng)cPKCs (包括PKCα，βⅠ，βⅡ和γ)的C2結(jié)構(gòu)與PIP2存在相互作用［1］。傳統(tǒng)PKCs(cPKCs)與細胞膜的結(jié)合是鈣依賴性的，有研究結(jié)果表明cPKCs的C2結(jié)構(gòu)可以通過β3–β4的區(qū)域與細胞膜上的PIP2相互作用，這對PKCs在細胞膜的定位具有很重要的意義，更有意思的是PKC只對PIP2的親和力高而與其他多聚磷酸磷脂酰肌醇沒有作用。進一步研究結(jié)果表明cPKCs的C2結(jié)構(gòu)與細胞膜PIP2的結(jié)合降低了PKC錨定在細胞上所需鈣離子的濃度［2］。細胞膜上PIP2的濃度可以影響PKCα在細胞膜上分布［3］:研究結(jié)果表明PC12細胞經(jīng)過ATP處理以后，細胞膜上PIP2的濃度升高同時使PKCα在細胞膜的分布范圍擴大，而這一過程卻與DAG的生成沒有關(guān)系。細胞膜上PIP2水平下降，使PKC蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)移減少，并且縮短了蛋白在細胞膜上的停留時間。實驗結(jié)果顯示PKCα的C2結(jié)構(gòu)中的多元酸富集區(qū)域是與PIP2相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這種相互作用與神經(jīng)細胞的分化有關(guān)。

2 PKC對細胞膜PIP2水平和分布影響

PIP2在細胞膜的合成主要受Ⅰ型磷脂酰-4-磷酸-5激酶的調(diào)控(PIP5K)，PIP5K催化PIP肌醇環(huán)5位發(fā)生磷酸化生成PIP2

［6］。如前所述PIP2是細胞眾多生命活動不可缺少的輔助因子，如網(wǎng)格蛋白依賴性的胞吐作用、非網(wǎng)格蛋白依賴的胞吐、鈣依賴的神經(jīng)遞質(zhì)和激素的分泌作用、細胞骨架肌動蛋白的重排、細胞遷移和整連蛋白介導的細胞基質(zhì)黏附作用等［7-8］。影響I型PI4P5K的因素主要是小G蛋白Rho、Rac和Cdc42［9］。PIP2的前體PI(4)P主要在高爾基體膜上生成并儲存［7］，PI4K以PI為底物催化肌醇環(huán)四位發(fā)生磷酸化［10］，但是PI4K確切的調(diào)控機制以及生成PIP如何轉(zhuǎn)運到細胞至今還不清楚。如前所述PIP2的合成是發(fā)生在細胞膜上的，因此我們可以推測在PI4K同工酶、小GTPase和轉(zhuǎn)運連接器或支架蛋白之間存在一種可調(diào)控的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以便于在高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成為滿足不同轉(zhuǎn)運途徑的聚集PIP的小池。而PI4K活性的影響因素近年也受到關(guān)注:在牛的精子獲能實驗中［11］，結(jié)果表明PI4K的激活有兩種途徑即直接被PKA激活，由PI3K介導;由PKC激活不依賴于PI3K。而本實驗室的研究結(jié)果也表明，爪蟾卵母細胞中細胞膜的去極化增加細胞膜PIP2水平［12］，而這一現(xiàn)象可能就是PKC介導的PI4K活性增加促進PIP2的合成［13］。

受體介導的PI4P生成增多依賴于PKC的活性。研究［18］揭示PKC抑制劑G?-6976(只對傳統(tǒng)的蛋白激酶C(cPKCs)和蛋白激酶D(PKD)有作用而對新型的蛋白激酶C (nPKCs)沒有作用)對卡巴膽堿所引起的細胞的PIP水平的升高沒有明顯作用。相反，G?-6976的結(jié)構(gòu)類似物G?-6983 (對傳統(tǒng)的和新型的蛋白激酶C都有抑制作用，但是對PKD沒有作用)卻能明顯抑制卡巴膽堿升高PIP的作用，同樣也影響了卡巴膽堿升高PIP2的作用。3 μmol·L-1的葡萄糖和1 μmol·L-1的PMA都能升高細胞PIP水平。與卡巴膽堿不同的是PMA升高PIP的作用并不依賴于細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，但是PMA的作用能夠被LY294002和G?-6983所抑制，而不被G?-6976抑制。因此作者認為受體激活介導的PIP合成增多和PLC介導的DAG升高以及PKC的激活有關(guān)。

3 PKC影響PIP2對離子通道的調(diào)節(jié)

隨著對PIP2作用研究的深入，PIP2對離子通道的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到大家公認。PIP2通過和細胞膜上的通道蛋白相互作用，發(fā)揮影響離子通道功能的作用。PKC是絲氨酸/酸酸磷酸激酶，許多實驗發(fā)現(xiàn)PKC使與PIP2有相互作用的離子通道蛋白發(fā)生磷酸化，改變通道蛋白與PIP2的親和力，從而影響PIP2對離子通道的調(diào)節(jié)作用。

在海馬神經(jīng)元中，毒蕈堿受體的激活后通過PLC/PKC通路抑制GIRK通道［14］;谷氨酸受體介導的電流抑制是通過PLA2/花生四烯酸通路。GqPCR引起的電流抑制的機制是由PKC和花生四烯酸介導的PIP2和通道的相互作用降低實現(xiàn)的［15］。研究發(fā)現(xiàn)PMA作為PKC的激動劑［16］可以抑制M電流［17］，但是機制尚未明確，有報道稱這種抑制作用是PKC對離子通道蛋白的直接作用，也有的稱是PKC通過影響PIP2水平而對電流產(chǎn)生抑制作用。

膽固醇抑制頸上神經(jīng)節(jié)M鉀電流的作用可以被PKC的抑制劑calphostin C所阻斷，實驗者同時也發(fā)現(xiàn)PKC的激動劑PDBu可以產(chǎn)生類似膽固醇的抑制M電流的作用，由此我們推測膽固醇對M電流的抑制作用是通過激活PKC來實現(xiàn)的。體外激酶活性測定實驗結(jié)果表明KCNQ2(M通道的分子組成之一)可以被PKC催化發(fā)生磷酸化。KCNQ2的突變體(缺乏PKC磷酸化位點)表達的M電流不受膽固醇或PDBu的影響。膽固醇抑制M電流作用機制是通道蛋白被PKC磷酸化。灌流PIP2可以減弱膽固醇和PDBu對電流的抑制作用，由此可推斷PKC磷酸化通道蛋白以后，降低了通道與PIP2的作用從而表現(xiàn)為電流的抑制作用［19］。

QT間期延長綜合癥可以引起尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速、心室顫動甚至猝死。QT延長綜合癥的主要遺傳因素是構(gòu)成復極化鉀電流IKs的KCNQ1基因的突變。研究表明［20］，腎上腺素受體激活PKA和GqPCR激活PKC都對IKs具有調(diào)節(jié)作用。進一步的研究［21］發(fā)現(xiàn)PKC介導的IKs的激活作用是通過調(diào)節(jié)通道和PIP2的親和力來實現(xiàn)的。突變通道對細胞膜PIP2水平的變化變得不敏感，但PKC激活以后可以加強PIP2與通道的親和力。由此可見PKC可以通過加強PIP2與通道的相互作用削弱突變通道對PIP2水平變化的去敏反應(yīng)。

研究者使用單通道記錄和免疫共沉淀技術(shù)研究了內(nèi)皮素-1激活新鮮分離的家兔冠狀動脈細胞內(nèi)源性TRPC1/C5/ C6通道的機制研究。ET(A)或ET(B)受體拮抗劑BQ-123和BQ788不能阻斷內(nèi)皮素-1激活的TRPC1/C5/C6通道，但是如果同時使用這兩種拮抗劑可以阻斷內(nèi)皮素-1的作用［22］。ET(A)和ET(B)受體激活所介導的通道激活作用可以被PKC的抑制劑白屈菜赤堿或抗TRPC1抗體所拮抗，這表明ET受體激活所介導的TRPC1通道的開放是依賴PKC的。同樣ET(A)受體所介導的TRPC1的開放可以選擇性被PI4K/PI3K抑制劑wortmannin(50 nmol·L-1)和PI-828所阻斷。PIP3是PI3K催化PIP2磷酸化的產(chǎn)物。外源性使用diC8-PIP3同樣可以激活PKC依賴的TRPC1的開放。這些實驗結(jié)果表明ET(A)受體激活引起的PKC依賴性的TRPC1通道的開放是通過PI3K催化PIP2生成PIP3來實現(xiàn)的。相反，ET(B)受體介導的TRPC1通道的開放可以被PLC的抑制劑U73122所阻斷，同時DAG的類似物OAG同樣可以啟動PKC依賴的TRPC1的開放。OAG的這種作用又可以被抗PIP2的抗體或高濃度的wortmannin(20 μmol·L-1)所阻斷。由此可知ET(B)受體介導的PKC依賴性的TRPC1通道的開放是通過PI-PLC介導DAG的生成以及PIP2依賴的。

4 結(jié)語

細胞信號傳導在1969年第一次由Martin Rodbell用來描述細胞接收、加工以及最后傳遞來自細胞外的“信號”如激素、藥物或者光照。細胞信號傳導過程錯綜復雜，PKCs毫無疑問參與了多條信號傳導通路發(fā)揮著重要的作用，熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用來研究PKCs的定位激活［24］，必定更有助于我們對PKCs調(diào)節(jié)作用的了解。PIP2對PKCs的影響主要是PIP2本身和PKC的相互作用;以及PIP2的代謝產(chǎn)物IP3和DAG對PKCs活性的調(diào)節(jié)。但是，對于PIP2的代謝調(diào)節(jié)仍然缺少充足的實驗證據(jù)。我們熟知PI4K和PIP5K是PIP2細胞合成必不可少的兩個酶，PKC在PIP2合成過程中所扮演的角色也在一步一步被揭示。先進的基因技術(shù)和蛋白質(zhì)組技術(shù)將會進一步回答我們今天遺留在PIP2信號通路領(lǐng)域的問題。

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Progress in the research of mutual regulation between PKC and PI(4，5)P2

CHEN Xing-juan，ZHANG Xi-dong，ZHANG Xuan，GAO Hai-xia，ZHANG Hai-lin
(Dept of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang050017，China)

Protein kinase C(PKC)comprises a multigene family of related serine/threonine kinases that sit at the crossroads of many signal transduction pathways，playing an important role with complex functions．Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate (PIP2)is a key signaling molecule in cell membrane;it is not only the precursor of soluble inositol phosphate(IP3)and diacylglycerol(DAG)，it can also act as a second messenger itself．Phospholipase C(PLC)hydrolyzes PIP2to generate membranebound DAG，which activates PKC，and IP3，which mobilizes intracellular calcium to regulate the activity of PKC．The activation of PKC increases the activity of PI4 kinase or PIP5 kinase to enhance the synthesis of PIP2．This review deals with the mutual regulation between PKCs and PIP2and current progress in related research．

protein kinase C;PIP2;Ca2+，PLC;signal transduction;regulation

10．3969/j．issn．1001-1978．2012．11．005

A

1001-1978(2012)11-1497-03

R-05;R329．25;R344．5;R345．57;R348．1

2012-06-03，

2012-08-25

國家自然科學基金重點項目(No 30730031)

陳興娟(1984-)，女，博士生，研究方向:分子藥理學，E-mail:xingjuanchen@yahoo．com;張海林(1960-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:分子藥理學，通訊作者，Tel:0311-86265562，E-mail:z_ hailin@hotmail．com

時間: 2012 - 10 - 29 16: 58 網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20121029.1658.005.html