徐建飛 ，王 偉，杜曉寧

(上?；ぱ芯吭荷虾７€(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

隨著人民物質(zhì)生活水平的提高，對(duì)食品安全的關(guān)注也越來越多。然而，目前食品安全卻不容樂觀，特別是動(dòng)物源性食品安全問題，已成為一個(gè)全球性的議題，獸藥殘留是導(dǎo)致食品安全性下降的一個(gè)主要原因。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)獸藥殘留聯(lián)合立法委員會(huì)的定義［1］，獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。隨著獸藥和藥物添加劑在畜禽飼養(yǎng)過程中的長(zhǎng)期不合理使用，殘留在動(dòng)物體內(nèi)的獸藥，隨著食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在威脅。因此，加強(qiáng)對(duì)獸藥殘留的檢測(cè)，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類的身體健康有著極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。硝基呋喃類藥物是一類化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，廣泛使用于敏感菌所致的泌尿系統(tǒng)感染治療，是可能被非法使用的一類違禁獸藥。近年來，質(zhì)譜技術(shù)以其分析更趨簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和快速的優(yōu)點(diǎn)，在獸藥殘留的檢測(cè)方面已得到廣泛的應(yīng)用。

1 硝基呋喃類獸藥殘留檢測(cè)方法

目前，廣泛使用的硝基呋喃類獸藥殘留檢測(cè)方法主要有微生物學(xué)檢測(cè)法、免疫分析法、儀器分析法、以及生物傳感器、納米材料、生物芯片等新技術(shù)［2］。

微生物學(xué)檢測(cè)法是測(cè)定抗生素殘留的經(jīng)典方法，具有前處理簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)以及批量大等優(yōu)點(diǎn)，但精確度、準(zhǔn)確度和特異性不高，缺乏靈敏度;免疫分析法雖然具有較高的檢測(cè)靈敏度，但此方法樣品前處理較復(fù)雜，假陽(yáng)性率高，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不能滿足快速、無(wú)損傷的檢測(cè)要求;生物傳感器和納米材料等新的檢測(cè)技術(shù)還不夠成熟，定量檢測(cè)結(jié)果也不穩(wěn)定。

儀器分析法主要指色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(如GC－MS、LC－MS、GC－IR/MS)。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其靈敏快速、分辨率高、重現(xiàn)性好以及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)而被歐盟、中國(guó)及其他國(guó)家列為指定的獸藥殘留分析手段。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)利用了液相色譜較強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜檢測(cè)器豐富的結(jié)構(gòu)信息，為目標(biāo)化合物提供了可靠的定性和定量結(jié)果。由于目前主流的篩選方法的局限性，其檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果都必須通過明確的驗(yàn)證方法來進(jìn)行定性和定量分析［3］，而質(zhì)譜能夠同時(shí)提供定性和定量信息，因此發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)于動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留檢測(cè)均要求采用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。

2 硝基呋喃類獸藥殘留檢測(cè)現(xiàn)狀

硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝速度快、半衰期短，難以檢出原藥殘留。出于安全性考慮，世界上絕大多數(shù)國(guó)家包括中國(guó)、歐盟、美國(guó)等規(guī)定在動(dòng)物食用組織中不允許有硝基呋喃類藥物的殘留。如歐盟已于1995年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類抗生素，并將其列為A類禁用藥物(EEC/1442/95 和 EEC/2901/93)［4－5］，歐盟公報(bào)(2003/181/EC)［6］中規(guī)定所有家禽肉類和魚類中的四種硝基呋喃類藥物的最低殘留量為1.0 μg/kg。我國(guó)也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類獸藥的禁令。

由于呋喃類藥物能快速代謝而不易在食用動(dòng)物組織中被檢測(cè)到，通過測(cè)定母體化合物的方法檢測(cè)硝基呋喃殘留是不合適的［7］，但硝基呋喃在動(dòng)物用藥后所形成的蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物則可能在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)留存在動(dòng)物可食組織中［8－9］。目前，歐盟國(guó)家要求以代謝產(chǎn)物為目標(biāo)分析物以達(dá)到檢測(cè)硝基呋喃殘留的目的。硝基呋喃類藥物及其對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物有呋喃唑酮(3－amino－2－oxaolidone，AOZ)、呋喃它酮(5－morpholino－3－amino－2－oxazolidone，AMOZ)、氨基脲(semicabazide，SEM)和氨基海因(1 － aminohydantoin，AHD)［10－11］。硝基呋喃代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、SEM、AHD可在酸性條件下水解，同時(shí)可用2－硝基苯甲醛(2－nitrobenzaldehyde，NBA)衍生化，其相應(yīng)衍生物分別是呋喃唑酮代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NPAOZ、呋喃它酮代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AMOZ、呋喃西林代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－SEM、呋喃妥因代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AHD，經(jīng)提取和進(jìn)一步凈化后，殘留量可用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)進(jìn)行檢測(cè)［12－13］。

3 LC-MS/MS在硝基呋喃類獸藥檢測(cè)中的應(yīng)用

林黎明等［14］提出采用乙酸乙酯提取，再用自行配制的液體凈化試劑進(jìn)行凈化，可適用于各種動(dòng)物組織的提取凈化，方法簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià);采用LC－MS/MS多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)，對(duì)4種代謝產(chǎn)物通過一級(jí)質(zhì)譜分別選擇其分子離子作為分母離子，與氣體碰撞后，再經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜分別選擇兩對(duì)子離子，進(jìn)行定性定量測(cè)定;研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)每一待測(cè)成分的兩對(duì)監(jiān)測(cè)離子進(jìn)行組合后，可更有效地利用串聯(lián)質(zhì)譜的定性和定量信息，改善了信噪比，提高了定量檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果實(shí)際測(cè)定樣品為FAPAS國(guó)際水平測(cè)試樣品，樣品基質(zhì)為豬腎，其中含有1～4種硝基呋喃代謝產(chǎn)物，稱取5.0 g樣品2份，按上述分析方法進(jìn)行操作，共檢測(cè)出兩種代謝物，分別為AMOZ和 AHD，含量分別為 1.9、0.76 μg/kg，添加回收率分別為68.2%和91.9%。

國(guó)內(nèi)的丁濤等［15－17］使用了 LC －MS/MS測(cè)定蜂王漿和蜜蜂中 AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4種硝基呋喃類藥物代謝殘留物的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質(zhì)沉淀劑，同時(shí)提供衍生化反應(yīng)所需的酸性環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呋喃它酮代謝物的檢測(cè)下限可以達(dá)到0.03 μg/kg，其他3種硝基呋喃類藥物的代謝物的檢測(cè)下限可以達(dá)到0.05 μg/kg，呋喃它酮代謝物的定量下限可以達(dá)到0.20 μg/kg，其他3種硝基呋喃類藥物的代謝物的定量下限可以達(dá)到0.25 μg/kg，線性范圍為0.4 ～20 ng/mL，添加回收率為97.7% ～104.8%(內(nèi)標(biāo)校正)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.7% ～9.7%。

祝偉霞等［18－19］建立了動(dòng)物性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物的測(cè)定方法，在酸性條件下水解，2－NBA進(jìn)行衍生化，乙酸乙酯提取，固相萃取柱Oasis HLB富集凈化，三級(jí)四極串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜正離子模式測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)定量。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性準(zhǔn)確可靠。通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，證明可用于動(dòng)物源性食品中四種硝基呋喃代謝物殘留的測(cè)定。

彭濤等［20－21］采用 LC －MS/MS同時(shí)測(cè)定奶粉中AOZ、AMOZ、SEM、AHD代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結(jié)合的代謝物，同時(shí)加入2－NBA，37℃過夜衍生化。加入硫酸鋅，調(diào)pH值至7.0后，再加入亞鐵氰化鉀去除蛋白。后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離正離子(ESI+)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。在添加濃度0.5 ～2 μg/kg 范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為 89.5% ～110.3%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于 11.3%。AMOZ、AOZ 檢出限為 0.05 μg/kg，SEM、AHD 為0.1 μg/kg。

趙善倉(cāng)等［22］建立和發(fā)展了畜產(chǎn)品4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的LC－MS/MS快速檢測(cè)方法，樣品中與蛋白結(jié)合的代謝物經(jīng)0.125 mol/L鹽酸水解，2－NBA在37℃衍生16 h。上清液調(diào)節(jié)pH=7.4，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，流動(dòng)相定容。外標(biāo)法定量，在添加濃度為 0.1～2.0 μg/kg范圍內(nèi)，4種代謝物的平均回收率在67.3% ～85.0%之間，10次測(cè)定結(jié)果的 RSD平均值在2.0% ～9.7% 之間。最低檢出限均達(dá)到 0.15 μg/kg，在0.10 ～20.00 ng/mL 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，實(shí)現(xiàn)了樣品檢測(cè)的快速、高靈敏和高的選擇性，適用于畜產(chǎn)品豬肉和豬肝中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測(cè)。

隨著硝基呋喃類獸藥殘留越來越引起人們的重視，國(guó)外一些專家和機(jī)構(gòu)紛紛研究此類藥物殘留的檢測(cè)方法，力求使最低檢測(cè)限達(dá)到最低。如Conneely A等［23］采用LC－MS/MS測(cè)定了豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的殘留量。樣品的凈化過程采用過2次SPE柱的方法，其中的雜質(zhì)和衍生化試劑干擾可以大大地降低。該方法在5.25 ng/g添加濃度下的回收率分別為(84±19.2)%和(90±16.3)%。2005年，他們進(jìn)一步研究了4種NFs(硝基呋喃類藥物)在豬體內(nèi)的代謝機(jī)理，并建立了豬肉、豬肝和豬腎中4種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留量的LC－MS/MS方法。他們通過給豬直接飼喂含四種硝基呋喃類添加劑的飼料，分別測(cè)定其藥物原形和代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，動(dòng)物組織中基本上未檢出原形藥物，而其代謝物的含量卻非常高，4種藥物的代謝物在豬體內(nèi)非常穩(wěn)定，停藥6個(gè)星期后依然可以被檢測(cè)出。

Leimer P等［24］建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中4種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留量的LC－MS/MS方法。樣品經(jīng)過聚苯乙烯SPE柱凈化后，藥物經(jīng)水解與組織蛋白離解開，即與2－硝基苯甲醛發(fā)生衍生化，形成相對(duì)穩(wěn)定的化合物。以2－硝基苯甲醛縮氨基脲為內(nèi)標(biāo)，在衍生化結(jié)束后加入樣品中，以考察基質(zhì)的離子抑制效應(yīng)。使用ESI正離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，檢出限在0.5 ng/g，而定量限在2.5～10 ng/kg之間，其定性定量均可滿足歐盟要求。

國(guó)外使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量和定性的分析也在逐漸推廣使用。如Effkemann等［25］采用穩(wěn)定性同位素雙標(biāo)化合物［1，2－15N，13C］－SEM 作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，研究了測(cè)定動(dòng)物組織和雞蛋中呋喃西林代謝物的方法，方法檢測(cè)限為10 μg/kg;Khong等［26］以穩(wěn)定性同位素氘代化合物(d4－SEM等)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，建立了通過質(zhì)譜方法測(cè)定蜂蜜中四種呋喃類獸藥殘留代謝物的方法，方法最終檢測(cè)限范圍在 0.12 ～0.56 μg/kg，定量限范圍在0.07 ～0.46 μg/kg，檢測(cè)誤差可控制在18%以內(nèi);Becalski等［27］以穩(wěn)定性同位素雙標(biāo)化合物13C，15N2－Semicarbazide作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過LC－MS/MS測(cè)定動(dòng)物組織中呋喃西林代謝物的方法，方法檢測(cè)限確定為 0.1 μg/kg;Mottier P 等［28］建立了基于同位素稀釋技術(shù)的4種硝基呋喃類獸藥殘留檢測(cè)方法。在酸性條件下把與蛋白結(jié)合的硝基呋喃類代謝物離解后，與2－NBA結(jié)合生成較為穩(wěn)定的化合物。經(jīng)液液萃取和固相萃取凈化后，進(jìn)行LC－ESI－MS/MS分析，方法對(duì)雞肌肉中按歐盟的要求進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，檢出限在0.11～0.21 μg/kg，而定量限在0.19 ～0.36 μg/kg。

4 硝基呋喃類藥物檢測(cè)存在的問題及展望

目前動(dòng)物性食品中硝基呋喃類藥物檢測(cè)存在著樣品前處理繁瑣，試劑用量大，檢測(cè)儀器昂貴，陽(yáng)性率高等問題。硝基呋喃類檢測(cè)的研究重點(diǎn)是在不需要衍生化步驟的情況下，直接檢測(cè)其代謝物來減少分析時(shí)間和成本。硝基呋喃類藥物殘留研究的另一方向是建立快速ELISA法，但目前商品化試劑盒只有單克隆抗體，若成功開發(fā)出4種呋喃類藥物的抗體檢測(cè)試劑盒，則能使硝基呋喃代謝物檢測(cè)達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、成本低廉、特異性強(qiáng)的目的。

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