王紅珊 李國(guó)豪 曹毅敏 林美儀 關(guān)愛萍 臧林泉 (廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 5080)

組胺是由L-組氨酸脫羧而成的一種廣泛分布于人體組織中的生物胺，其生理功能主要通過(guò)其受體發(fā)揮。目前發(fā)現(xiàn)的組胺受體主要有H1、H2、H3和H4，這四種受體在表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其生理功能等方面均存著明顯不同。而其中H4受體作為最新發(fā)現(xiàn)的一種亞型，目前在國(guó)內(nèi)外臨床上受到高度關(guān)注〔1〕。本文旨在探討其基因多態(tài)性與結(jié)腸癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我科2006年1月至2010年1月收治的65例結(jié)腸癌患者，其中男38例，女27例，年齡41～72〔平均(52.3±6.5)〕歲;所有患者均經(jīng)病理檢查確診，根據(jù) WHO 2000年大腸腫瘤組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，18例為高分化腺癌、25例為中分化腺癌、22例為低分化腺癌。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集與總RNA測(cè)定 取65例患者的結(jié)腸腫瘤標(biāo)本(腫瘤組)及距腫瘤組織至少5 cm以上的正常結(jié)腸組織標(biāo)本(癌旁組)，同時(shí)取65例無(wú)結(jié)腸癌患者的正常結(jié)腸組織作為正常組。將取出的組織立即置入液氮中，然后再轉(zhuǎn)至超低冰箱(－70℃)內(nèi)保存待用。采用 Trizol法提取標(biāo)本內(nèi)總 RNA，取3 μl置入瓊脂糖凝膠(1.0%)內(nèi)，進(jìn)行總 RNA 質(zhì)量的鑒定〔2〕，然后采用紫外分光儀對(duì)總RNA的濃度和純度分別進(jìn)行測(cè)定，其他RNA繼續(xù)放回超低冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 RNA分析 對(duì)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行分析，定性:對(duì)RNA質(zhì)量采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)有無(wú)明顯rRNA區(qū)帶及Smear樣染色進(jìn)行定性判斷。定量:根據(jù)紫外分光光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判斷，1.8＜A260/280＜2.0視為純度很高。

1.2.3 合成cDNA第一鏈 先將EP管用DEPC浸泡，然后將2 μl總RNA溶液置入，先在70℃條件下孵育10 min，再轉(zhuǎn)放在冰上，分別按要求加入氯化鎂溶液、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、RNA酶抑制劑等溶液適量〔3〕，將最終溶液離心數(shù)秒，依次孵育(42℃)、水浴(95℃)后置入－20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應(yīng) 參照基因選擇磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因，將合成的cDNA為模板，在DNA聚合酶和上下引物作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為95℃，5 min，每份標(biāo)本在相同條件下操作3次，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)束后，取出凝膠置入暗箱式紫外投射儀下進(jìn)行仔細(xì)觀察并記錄，然后借助凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)每條DNA條帶的A值進(jìn)行檢測(cè)，目的基因相對(duì)含量為目工基因A值與GAPDH的A值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

所有標(biāo)本總RNA抽提質(zhì)量可靠，所有待檢標(biāo)本以GAPDH基因作為參照，均為陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)果顯示RT-PCR特異性高。腫瘤組與癌旁組H4受體mRNA基因表達(dá)量(0.3954±0.0428 vs 0.5369±0.0582)比較(t=26.65，P ＜0.05)，癌旁組與正常組(0.6209±0.0782)比較(t=11.34，P ＜0.05)，腫瘤組與正常組比較(t=42.27，P＜0.05)，三組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Q檢驗(yàn)，腫瘤組、癌旁組及正常組結(jié)腸組胺H4受體mRNA表達(dá)呈逐級(jí)遞增趨勢(shì)(P＜0.05)。

3 討論

組胺H4受體是一種由390個(gè)氨基酸殘基組成的G蛋白耦聯(lián)受體，與H3受體具有高達(dá)37% ～43%的同源性〔4〕，且其中跨膜區(qū)域同源性更高，定位于人類18號(hào)染色體。對(duì)于組胺H4受體的研究表明，它具有獨(dú)特的藥理學(xué)特點(diǎn)及特殊的組織學(xué)分布，與其他三種受體不同，更多見于外周組織，而且高度表達(dá)于炎癥反應(yīng)組織器官及造血細(xì)胞中〔5〕，它的這種獨(dú)特性可能與其參與免疫調(diào)節(jié)及造血等生理功能有關(guān)，但這僅僅是在組胺H4受體發(fā)現(xiàn)后的一種初步研究結(jié)果。

長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)組胺H1受體和組胺H2受體研究較多，而且臨床上已研究出多種這兩種受體拮抗劑，而且已廣泛用于臨床。隨著2000年受體組胺H4受體的發(fā)現(xiàn)及近些年分子克隆技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于組胺H4受體的研究取得了許多新的突破和進(jìn)展。國(guó)外有學(xué)者采用RT-PCR方法也證實(shí)了外周組織中存在組胺H4受體mRNA的表達(dá)，而且研究結(jié)果還表明其在免疫組織、免疫器官及造血干細(xì)胞、骨髓、脾肺等外周造血器官內(nèi)優(yōu)先表達(dá)，且呈高度表達(dá)狀態(tài)〔6〕。目前許多關(guān)于組胺H4受體與變應(yīng)鼻炎的研究結(jié)果也證實(shí)，在鼻炎患者中這種組胺H4受體表達(dá)明顯增加〔7〕。而且，組胺H4受體在肝癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，許多臨床專家便推測(cè)組胺H4受體在癌癥、過(guò)敏反應(yīng)等疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用〔8〕。

本研究結(jié)果提示，在結(jié)腸癌組織中組胺H4受體的mRNA表達(dá)降低，使組胺H4受體的免疫應(yīng)答能力降低，促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展。

1 Zhang M，Venable JD，Thurmond RL.The histamine H4 receptor in autoimmune disease〔J〕.Exprt Opin Investig Drugs，2006;15(11):1443-52.

2 王紅珊，臧林泉，潘雪刁.人原發(fā)性肝癌組織中組胺H4受體基因表達(dá)和意義〔J〕.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007;23(1):67-70.

3 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科分會(huì).變應(yīng)性鼻炎的診治原則和推薦方案(2004年，蘭州)〔J〕.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2005;40(3):166-7.

4 王紅珊，王乃平，周宏灝.新型組胺受體:組胺H4受體〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004;20(7):731-4.

5 張孟賢，于世英.趨化性細(xì)胞因子受體CXCR4在大腸癌的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.世界華人消化雜志，2007;15(7):772-6.

6 燕志強(qiáng)，張 俊，李得本，等.變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜中組胺H4受體的差異性表達(dá)〔J〕.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010;24(20):928-30.

7 閆慶輝，張國(guó)建，任鵬濤，等.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體DR4在大腸癌的表達(dá)及意義〔J〕.世界華人消化雜志，2006;14(3):332-5.

8 Godot V，Arock M，Garcia G，et al.H4 histamine receptor mediates optimal migration of mast cell precursors to CXCL12〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2007;120(4):827-34.