鄧宇虹 鄭祝劍 邱曉露 徐琨

（1江西省兒童醫(yī)院 南昌330006；2江西醫(yī)學(xué)院上饒分院 上饒334000；3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 南昌330006）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是肺對不同情況下嚴(yán)重?fù)p傷時的非特異性反應(yīng)，其特征是嚴(yán)重的進(jìn)行性呼吸衰竭，盡管吸入高濃度氧仍不能糾正，是在搶救或治療的過程中發(fā)生以肺微循環(huán)障礙為主的小兒急性呼吸窘迫和低氧血綜合征。TLR4是一種跨膜蛋白，人類編碼的基因定位在9q32-q33，這種蛋白由胞外區(qū)、跨膜段和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。胞外區(qū)主要含十幾到二十幾個串連的富含亮氨酸重復(fù)序列(1eucine rich repeats,LRRs)。LRRs有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互粘附，識別病原體或其產(chǎn)物。胞內(nèi)區(qū)由Toll同源結(jié)構(gòu)域(Toll Homology domain，TH domain)和分子羧基端長短不同的短尾肽組成。TH結(jié)構(gòu)域是下游進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心元件，此區(qū)域關(guān)鍵位點的突變或序列缺失將阻斷信號向下傳遞。當(dāng)編碼刪的基因突變，就會導(dǎo)致其編碼蛋白改變，從而使信號傳導(dǎo)發(fā)生變化，影響一系列反應(yīng)。ALI／ARDS中病原微生物抗原和內(nèi)源性抗原等配體被肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的TLR4識別后，早期激活NF-kB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子以激活細(xì)胞，誘導(dǎo)以中性粒細(xì)胞浸潤、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與蛋白液體滲漏為特征的炎癥反應(yīng)。后期，TLR4介導(dǎo)炎癥反應(yīng)修復(fù)，以維持肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)，促進(jìn)ALI／ARDS的康復(fù)[1]。本研究通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)及基因測序技術(shù)檢測兒童ARDS患者TLR4等位基因Asp299Gly和Thr399Ile基因型的多態(tài)性，分析TLR4基因多態(tài)性與兒童ARDS之間是否存在相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象 ARDS組兒童急性呼吸窘迫綜合征患者為2007年10月～2012年8月就診于江西省兒童醫(yī)院PICU和NICU的48例患者，對照組為兒童保健科59名體檢者。兒童ARDS患者診斷均符合2006年中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會制定的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南。樣本提取：每個人均抽3 mL抗凝靜脈血，使用蛋白酶/酚/氯仿法提取基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 TLR4-Thr399Ile、Asp299Gly基因多態(tài)性檢測根據(jù)GenBank中TLR4受體基因序列（基因號：AH009665）設(shè)計引物，引物序列由上海生工公司合成。引物如下：Thr399Ile引物的序列為：A1：5'-GGT TGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGAGAA-3'；A2: 5'-CCTGAAGACTGGAGAGTAGTTAAATGCT-3'。Asp299Gly引 物 的 序 列 為 ：B1：5'-GATTAGC ATACTTAGACTACTACCTCCATG-3';B2：5'-GAT CAACTTCTG AAAAAGCATTCCCAC-3'。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系 在25 μL反應(yīng)體系中含有DNA 2.0 μL，10×buffer 2.5 μL，ddH2O 17.5 μL，dNTPs 0.5 μL，1 μmol/L引物各1.5 μL。Tap聚合酶1.0 μL。循環(huán)條件：95℃30 s、55℃30 s、72℃30 s，36個循環(huán)，最后72℃充分延伸5 min。取5 μL產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）分析取檢測有目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物并加入10×buffer 1 μL，針對位點Asp299Gly用限制性內(nèi)切酶Ncol 1 μL，針對位點Thr399Ile用限制性內(nèi)切酶Hinf-I 1 μL，在恒溫水浴箱37℃水浴20 h。酶切產(chǎn)物和相應(yīng)的PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳，B紫外透射凝膠成像儀系統(tǒng)觀察結(jié)果，并用數(shù)碼攝像機(jī)拍攝圖像保存。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 常用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律計算基因型和等位基因頻率，所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS11.5軟件，等位基因頻率在組間的差異分析采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4基因多態(tài)性結(jié)果 Thr399Ile基因多態(tài)性PCR產(chǎn)物可被Hinf-I內(nèi)切酶解成377 bp和29 bp的兩個片段。電泳后僅出現(xiàn)406 bp條帶的基因型為Thr/Thr，同時出現(xiàn)377、29 bp條帶的基因型為Ile/Ile，同時出現(xiàn) 406、377、29 bp的基因型為Thr/Ile。 Asp299Gly基因多態(tài)性 PCR產(chǎn)物可被Nco1內(nèi)切酶解成223 bp和26 bp的兩個片段。電泳后僅出現(xiàn)249 bp條帶的基因型為Asp/Asp，同時出現(xiàn)223、26 bp條帶的基因型為Gly/Gly，同時出現(xiàn)249、223、26 bp的基因型為Asp/Gly。

2.2 TLR4基 因 Thr399Ile、Asp299Gly與 兒 童ARDS的相關(guān)性 兒童ARDS組和對照組Thr399Ile和 Asp299Gly基因型頻數(shù)分布符合Hardy-Weinberg平衡。TLR4基因Thr399Ile位點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），相應(yīng)等位基因間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。Asp299Gly的基因突變率較低，所有樣本僅在兒童ARDS組檢測到2例，其余均為純合子。兒童ARDS組與對照組相比，TLR4基因Asp299Gly位點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組TLR4 Thr399Ile的基因型和等位基因頻率 例

表2 兩組TLR4 Asp299Gly的基因型和等位基因頻率 例

3 討論

病原微生物具有一些保守分子結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞壁含有的肽聚糖、脂多糖等，這些物質(zhì)對TLR4具有活化作用，稱為病原相關(guān)分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern，PAMPs）。TLR4是識別類脂PAMP的，其作用較為局限，可能主要參與內(nèi)毒素的識別與信號傳導(dǎo)過程[2]。TLR4主要在肺巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞、枯否細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及人類胚胎腎細(xì)胞、齒齦纖維母細(xì)胞及人表皮內(nèi)皮細(xì)胞等[3]分布。TLR4的信號傳導(dǎo)途徑可以通過髓樣分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88)依賴途徑和MyD88非依賴途徑。病原微生物抗原和內(nèi)源性抗原等配體被肺內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的TLR2、TLR4識別后，通過依賴MyD88或非依賴MyD88信號傳導(dǎo)途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子 (NF)-kB，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-l、環(huán)氧合酶2、細(xì)胞內(nèi)黏附分子1、膠原酶等多種細(xì)胞因子及化學(xué)因子的生成與釋放，引發(fā)以中性粒細(xì)胞浸潤、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與蛋白液體滲漏為特征的炎癥反應(yīng)[4]。Togbe等報道吸入脂多糖誘導(dǎo)的急性肺部炎癥和氣道上皮損害程度以及肺泡損傷后滲漏的蛋白量與TLR4表達(dá)水平呈劑量依賴關(guān)系，而不表達(dá)TLR4的TLR4基因突變的小鼠(C57BuloscNQ)肺泡蛋白量與正常對照組沒有差異[5]。阻斷TLR4可抑制內(nèi)毒素對內(nèi)皮細(xì)胞的激活作用，提示TLR4也可能是內(nèi)毒素作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的受體途徑。TLR4主要識別脂多糖、紫杉醇、HSWoO、HSP70、HSP96、呼吸道合胞病毒融合蛋白、血纖維蛋白原和透明質(zhì)酸寡糖等[3]。

近年來關(guān)于TLR4基因多態(tài)性與感染性疾病易感性的相關(guān)研究已逐步引起關(guān)注，目前對TLR4研究最多的單核苷酸多態(tài)性（SNP）是Asp299Gly和Thr399Ile兩個位點的突變，位于TLR4轉(zhuǎn)錄起始處第三外顯子上即編碼LRR的區(qū)域，一種SNP是位于1 196位的C/T堿基轉(zhuǎn)換，使位于399的蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，而另一種SNP是位于第896位點的A/G堿性轉(zhuǎn)換，使氨基酸序列第299位置的天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼醄6]。

本研究我們采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法，對48例ARDS患兒和59名健康兒童進(jìn)行TLR4等位基因Thr399Ile和Asp299Gly的基因型檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ARDS患兒和健康體檢者中，TLR4受體基因Thr399Ile、Asp299Gly兩位點的基因型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.010，P=0.920；χ2=0.412，P=0.52）。表明感染性 ARDS患者的TLR4基因Asp299Gly和Thr399Ile多態(tài)性與兒童ARDS發(fā)病無顯著相關(guān)性，這可能與樣本量有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

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