曹唯儀，黃鎮(zhèn)林，何亮穎，趙韶華，王玉蓉

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102;2.河北以嶺醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 050035)

蟬蛻(Cryptotympana pustulate Fabricius)為蟬科昆蟲(chóng)黑蚱羽化時(shí)脫落的皮殼，性寒、味咸，辛涼解表，長(zhǎng)于疏風(fēng)清熱、明目退翳、透疹止癢、利咽、解痙。臨床多用于治療風(fēng)熱感冒、咽痛音啞、麻疹不透、風(fēng)疹瘙癢、目赤翳障、驚風(fēng)抽搐及破傷風(fēng)等，為中國(guó)藥典2010年版(一)部收載［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蟬蛻除具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解痙等作用外，還具有一定的抗凝作用，如蟬蛻水提液可顯著降低高脂血癥大鼠紅

基金項(xiàng)目:北京中醫(yī)藥大學(xué)復(fù)方中藥制藥研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(2011-CXTD-13)

作者簡(jiǎn)介:曹唯儀(1989-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2011級(jí)中藥制藥學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生，主要研究方向:中藥復(fù)方新型釋藥系統(tǒng)研究。

通訊作者:王玉蓉(1951-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:中藥復(fù)方新型釋藥系統(tǒng)研究。

收稿日期:2012-07-12

修回日期:2012-08-10

細(xì)胞聚集指數(shù)

［2］

，抵抗體外血栓形成，并能明顯緩解哮喘的“微觀血瘀”狀態(tài)

［3］

。臨床研究發(fā)現(xiàn)，蟬蛻與水蛭、?蟲(chóng)、全蝎等配伍同用，能明顯抑制血栓形成和血小板聚集，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，對(duì)絡(luò)脈瘀阻的心血管系統(tǒng)疾病有很好的治療作用

［4］

，但其有效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報(bào)道尚少。為此，本研究擬通過(guò)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血小板聚集率和血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖試驗(yàn)，比較并綜合評(píng)價(jià)蟬蛻仿生胃/胰蛋白酶解物、水提物、醇提物、水提醇沉物抗凝纖溶活性，為蟬蛻工藝篩選和抗凝物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器 800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);ES-120型電子分析天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司);恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠);DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);LGPABER-Ⅰ型血小板聚集儀(北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 蟬蛻(由石家莊以嶺醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供);胃蛋白酶1:10 000(Sigma P7000，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);胰蛋白酶1:250(Amresco0458，北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司);PT試劑盒(上海太陽(yáng)生物試劑公司);APTT試劑盒(上海太陽(yáng)生物試劑公司);乙醇(分析純);ADP(Sigma，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純);枸櫞酸鈉(西隴化工股份有限公司，分析純)。

1.3 動(dòng)物 家兔20只，購(gòu)自北京海淀興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量約2kg，雌雄各半，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2011-0006。

2 方法

2.1 蟬蛻不同提取物的制備

2.1.1 仿生酶解［5］稱(chēng)取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加入人工胃液(取鹽酸9mL，加蒸餾水稀釋成1 000mL，即得)，密閉，于37℃恒溫水浴作用30min后，加入3.0%胃蛋白酶水解3h，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4 500r/min離心15min，取上清液水浴揮干，即得蟬蛻胃蛋白酶酶解物。殘?jiān)Q(chēng)重按固液比1∶20加入人工腸液(取 0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液 250mL，加0.2mol/L溶液118mL，用水稀釋至1 000mL，搖勻，即得)，密閉，于45℃恒溫水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85℃恒溫水浴作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4 500r/min離心15min，取上清液，干燥即得蟬蛻胰蛋白酶酶解物。

2.1.2 水提取 稱(chēng)取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加蒸餾水，回流提取3次，每次2h，合并提取液，干燥，即得蟬蛻水提物。

2.1.3 乙醇提取 稱(chēng)取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250mL圓底燒瓶，分別按固液比1∶20加乙醇70%、90%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，回收干燥，即得蟬蛻70%、90%醇提物。

2.1.4 水提醇沉 稱(chēng)取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加蒸餾水，回流提取3次，每次1h，合并提取液，濃縮至藥液比1∶1，加入95%乙醇至含醇量70%，置冰箱中放置過(guò)夜后4 500r/min離心15min，取上清液回收干燥，即得蟬蛻70%水提醇沉物。同法操作，加入95%乙醇至含醇量90%，置冰箱中放置過(guò)夜后4 500r/min離心15min，取上清液回收干燥，即得蟬蛻90%水提醇沉物。殘?jiān)稍?，即得醇沉渣?/p>

2.2 抗凝纖溶藥效試驗(yàn)

2.2.1 供試品溶液的制備 取上述適量蟬蛻提取物，加生理鹽水或90%乙醇配制成濃度為10mg/mL溶液，即為供試品溶液。

2.2.2 血漿制備 取健康家兔(雌雄各半，產(chǎn)地北京)耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉，頸動(dòng)脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，混勻后以1 000r/min離心10min，取上清液，即得富血小板血漿(PRP)，以3 000r/min離心10min，取上清液，即得貧血小板血漿(PPP)。

2.2.3 PT試驗(yàn)［6］取 PPP100μL于測(cè)試杯中，加樣品液10μL，37℃預(yù)溫3min，加入 PT 試劑 200μL(預(yù)溫3min)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準(zhǔn)確記錄凝固時(shí)間。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對(duì)照(每個(gè)樣品平行測(cè)定6份)。

2.2.4 APTT試驗(yàn)［6］取 PPP100μL于測(cè)試杯中，加樣品液10μL，37℃預(yù)溫3min，加入 APTT試劑100μL(預(yù)溫 5min)，孵育 5min后加入 CaCl2100μL(預(yù)溫15min)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準(zhǔn)確記錄凝固時(shí)間。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對(duì)照(每個(gè)樣品平行測(cè)定6份)。

2.2.5 血小板聚集率試驗(yàn)［7］PPP調(diào)零后，將PRP 300μL與樣品液10μL置于測(cè)試杯中37℃預(yù)溫10min，加入誘導(dǎo)劑ADP(1mmol/L)10μL，測(cè)定10min內(nèi)血小板最大聚集率。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對(duì)照(每個(gè)樣品平行測(cè)定6份)。

血小板最大聚集率=PRP最大聚集時(shí)與基線之間的距離/90×100%

血小板聚集抑制率=(對(duì)照管血小板聚集率%-給藥管聚集率%)/對(duì)照管血小板聚集率% ×100%

2.2.6 血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖試驗(yàn)［7］取PRP 150μL與樣品液10μL混勻，37℃預(yù)溫10min，PPP調(diào)零，同時(shí)加入0.1mol/L CaCl250μL，攪動(dòng)10s，平衡記錄儀記錄動(dòng)態(tài)圖，直至圖形峰值持續(xù)穩(wěn)定2min為止，以生理鹽水或90%乙醇為陰性對(duì)照(每個(gè)樣品平行測(cè)定6份)。所得曲線即為血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖。根據(jù)動(dòng)態(tài)圖觀察以下參數(shù):

1)凝固啟動(dòng)時(shí)間(CST):即從曲線開(kāi)始前，與橫軸平行的直線線段。CST反映從凝固劑加入到纖維蛋白開(kāi)始形成所需要的時(shí)聞，是體現(xiàn)血凝開(kāi)始快慢的參數(shù)。2)最大凝固程度(MCE):即曲線上升的峰值段，也是開(kāi)始凝固到凝固完全時(shí)透光度變化的峰值。MCE的高低與測(cè)定用血漿量，即纖維蛋白原水平有關(guān)。它表示液態(tài)的纖維蛋白原已基本凝固成凝膠態(tài)的纖維蛋白，凝固反應(yīng)已基本完成。3)凝固時(shí)間(CT):即從曲線開(kāi)始到曲線峰值所需的時(shí)間，CT是血漿開(kāi)始凝固到凝固完全所需的時(shí)間，是反映血漿凝固快慢的參數(shù)。4)平均凝固速度(ACR):即MCE/CT的比值，代表平均每秒鐘形成的凝固程度，ACR是反映纖維蛋白形成，即血凝反應(yīng)速度的參數(shù)。

圖1 纖溶圖示意圖CST:a-b;MCE:c-d;CT:b-c;ACR=MCE/CT

2.3 計(jì)算與統(tǒng)計(jì) 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，方差分析和雙側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 PT與APTT藥效考察 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蟬蛻不同工藝提取物PT、APTT藥效考察(±s，n=5)

表1 蟬蛻不同工藝提取物PT、APTT藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱(chēng) PT(s) APTT(s)生理鹽水對(duì)照組 胃蛋白酶解物6.99±0.14 15.61±1.44胰蛋白酶解物 6.99±0.18 31.00±1.19*水提物 7.45±0.20 32.70±1.10＊＊90%水提醇沉(渣)6.95±0.15 32.04±1.01＊＊生理鹽水(空白) 7.24±0.11 29.98±0.65 90%乙醇對(duì)照組 70%乙醇提取物 6.68±0.19 44.05±1.59 90%乙醇提取物 5.93±0.24 47.80±0.94 70%水提醇沉物 7.29±0.17 48.24±1.38 90%水提醇沉物 6.85±0.12 49.48±1.56 90%乙醇(空白)7.93±0.13 49.95±1.27

PT結(jié)果表明，所有蟬蛻提取物均不能明顯延長(zhǎng)PT值，推測(cè)其抗凝作用可能與外源性凝血系統(tǒng)無(wú)關(guān)。

APTT結(jié)果表明，與生理鹽水對(duì)照，胰蛋白酶解物、水提物、90%水提醇沉(渣)可延長(zhǎng)APTT，推測(cè)其可干擾內(nèi)源性凝血因子的活性，達(dá)到抗凝作用。

3.2 血小板聚集率藥效考察 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蟬蛻不同工藝提取物血小板聚集率藥效考察(±s，n=5)

表2 蟬蛻不同工藝提取物血小板聚集率藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱(chēng) 血小板聚集率(%)血小板抑制率(%)生理鹽水對(duì)照組 胃蛋白酶解物83.27±4.59 0.09胰蛋白酶解物 71.68±4.87＊＊ 0.22水提物 84.22±11.44 0.08 90%水提醇沉(渣)76.52±5.62* 0.16生理鹽水(空白) 91.33±11.78 0.00 90%乙醇對(duì)照組 70%乙醇提取物 17.63±3.17 -0.20 90%乙醇提取物 9.65±2.32＊＊ 0.34 70%水提醇沉物 14.72±2.85 0.00 90%水提醇沉物 24.10±3.43 -0.64 90%乙醇(空白)14.72±1.35 0.00

結(jié)果表明:與生理鹽水為對(duì)照，蟬蛻胰蛋白酶解物、90%水提醇沉(渣)具有顯著抑制血小板聚集的作用;與90%乙醇為對(duì)照，以90%醇提物抑制血小板聚集的作用最為明顯。

3.3 血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖藥效考察 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蟬蛻不同工藝提取物血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖藥效考察(±s，n=5)

表3 蟬蛻不同工藝提取物血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱(chēng) CST(s) CT(s) MCE(%) ACR(%/s)生理鹽水對(duì)照組 胃蛋白酶解物 306.50±15.60＊＊ 34.00±11.31*25.92±6.98 0.76胰蛋白酶解物 259.33±8.89 27.83±9.35 25.65±7.78 0.92水提物 212.50±6.38 24.00±3.03 43.88±10.66 1.83 90%水提醇沉(渣) 166.00±6.63 22.83±4.07 15.85±5.67* 0.69生理鹽水(空白) 259.33±7.23 22.00±2.90 35.07±15.43 1.59 90%乙醇對(duì)照組 70%乙醇提取物 256.33±10.63 4.83±2.48 5.08±3.52 1.05 90%乙醇提取物 253.50±7.40 4.67±2.94 5.35±4.39 1.15 70%水提醇沉物 254.50±5.47 4.17±1.17 5.10±4.09 1.22 90%水提醇沉物 269.33±6.09＊＊ 4.33±2.94 5.78±4.80 1.33 90%乙醇(空白)243.50±11.90 4.67±2.07 5.15±3.60 1.10

結(jié)果表明，與生理鹽水對(duì)照，蟬蛻胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)不同程度的延長(zhǎng)CT，降低MCE和ACR，而對(duì)CST的影響只有胃蛋白酶解物能夠顯著延長(zhǎng)，胰蛋白酶酶解物延長(zhǎng)并不顯著，說(shuō)明蟬蛻胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)提取方法主要是通過(guò)抑制纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，減慢血漿凝固，達(dá)到抗凝效果。90%乙醇對(duì)照組中，只有90%水提醇沉物表現(xiàn)出延長(zhǎng)CST作用，對(duì)CT、MCE、ACR 效果不顯著。

3.4 結(jié)論分析 結(jié)果如表4。

表4 蟬蛻不同提取方法抗凝指標(biāo)綜合結(jié)果

結(jié)論:APTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白酶解物、水提物和90%水提醇沉(渣)具有明顯的抗凝效果;血小板聚集率實(shí)驗(yàn)表明，胰蛋白酶解物、90%醇提物和90%水提醇沉(渣)具有明顯的抗血小板聚集效果;血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖藥效以平均凝固速度(ACR)值表明，胃/胰蛋白酶解物和90%水提醇沉(渣)效果最為明顯。

4 討論

本研究以PT、APTT、血小板聚集率、血凝-纖溶動(dòng)態(tài)圖四項(xiàng)抗凝纖溶藥效為指標(biāo)，考察了蟬蛻仿生酶解法、水提法、醇提法、水提醇沉法不同提取方法，得到8種提取物的抗凝纖溶效果。

由于提取物溶解度的不同，分別選用生理鹽水或90%乙醇作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，生理鹽水溶解的各組對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于90%乙醇組，推測(cè)原因可能是乙醇本身對(duì)血漿中凝血因子、血小板、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有影響而造成的結(jié)果偏差。

結(jié)果表明，蟬蛻八種提取物對(duì)PT指標(biāo)均無(wú)明顯作用，推測(cè)提取物均不是通過(guò)外源性凝血途徑抗凝，提示系通過(guò)內(nèi)源性凝血途徑達(dá)到抗凝;APTT、血小板聚集率、血凝-纖溶三項(xiàng)指標(biāo)顯示，仿生胃/酶蛋白酶解物和水提醇沉(渣)均表現(xiàn)出顯著的抗凝作用，因此在抗凝纖溶作用方面，選取仿生酶解提取法或水提醇沉法作為繼續(xù)研究對(duì)象更具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值。

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