魏文茂，朱麗麗，羅華麗，蒲曉東(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016)

近年來隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人均消耗酒精量也在不斷的增加，酒精性脂肪肝病在我國發(fā)病率不斷攀升，是臨床上最常見、最早期的酒精性肝病(alcoholic liver disease)之一，乙醇會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷肝臟功能，80%以上重度飲酒者都有不同程度脂肪肝產(chǎn)生［1］?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)對(duì)其治療效果不明顯，也還沒有特異性的治療方法，而且副作用比較明顯［2－3］。但傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)通過辨證論治治療對(duì)酒精性脂肪肝有其獨(dú)特的療效。雙葛解酲丸是一種新研制的經(jīng)過臨床檢驗(yàn)效果顯著的中藥復(fù)方藥劑，本實(shí)驗(yàn)通過酒精灌胃建立酒精性脂肪肝的大鼠模型，通過檢測血清谷胱甘肽－過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－PX)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)的表達(dá)水平，來研究雙葛解酲丸減輕酒精性脂肪肝大鼠肝臟的脂肪變性和炎癥介質(zhì)浸潤的損傷和保護(hù)肝臟的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠65只，體質(zhì)量(175±25)g，雄性32只，雌性33只，購買于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，喂養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及器材海王金樽片購買于桐君閣大藥房(1.0 g/片，深圳市海王健康發(fā)展有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20101025);56°紅星二鍋頭購買于重慶百貨商場(北京釀造總廠2009年生產(chǎn));雙葛解酲丸湯劑(重慶市桐君閣大藥房提供，由重慶醫(yī)科大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室熬藥制備成1 g生藥/mL的濃縮液);SOD試劑盒(批號(hào)20110613);MDA試劑盒(批號(hào)20110620);GSH－PX(批號(hào)20110623)(均由南京建成生物工程研究所提供);賽多利斯BS110S電子秤(德國賽多利斯股份公司);UNICO7200分光光度計(jì)(北京谷美特科技有限公司);80－2型低速離心機(jī)(金壇市天瑞儀器配件廠);100°水浴箱(北京艾飛博科技有限公司);HH－4恒溫水浴箱(江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

1.3 建立酒精性脂肪肝模型大鼠65只，隨機(jī)分成2組，酒精性脂肪肝組(54只)，每日喂養(yǎng)普通飼料，并以56°白酒10 mL/kg灌胃2次，上下午各1次，連續(xù)灌胃8周。空白對(duì)照組11只，每日喂養(yǎng)普通飼料并灌胃10 mL蒸餾水，上下午各1次，連續(xù)灌胃8周。8周后，取酒精性脂肪肝組4只大鼠與空白對(duì)照組1只大鼠處死后，取肝臟進(jìn)行病理切片對(duì)比后證實(shí)脂肪肝已形成，繼而停止造模，進(jìn)行藥物治療。將50只酒精性脂肪肝組大鼠隨機(jī)分模型對(duì)照組、雙葛解酲丸低劑量組、雙葛解酲丸中劑量、雙葛解酲丸高劑量組和海王金樽組5個(gè)組別，低劑量組灌胃雙葛解酲丸5 g/(kg·d)，中劑量組灌胃雙葛解酲丸10 g/(kg·d)，高劑量組灌胃雙葛解酲丸20 g/(kg·d)，海王金樽組灌胃海王金樽片1.5 g/kg灌胃，分別每日灌胃2次，上下午各1次，空白對(duì)照組以10 mL蒸餾水灌胃持續(xù)4周。

1.4 標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)的12周末，大鼠禁食24 h后稱質(zhì)量，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后經(jīng)心臟穿刺采血快速取出肝臟，每只均于肝左葉取材3塊，用于病理切片。采集血液于清潔塑料離心管中靜置后，并在低溫離心機(jī)上3 000 r/min離心15 min，常規(guī)收集血清置于－80°冰箱保存待測。

1.5 檢測項(xiàng)目和方法觀察身體特征:大鼠的活動(dòng)情況及精神狀態(tài)，肝臟質(zhì)量、外觀、色澤、形狀、質(zhì)地以及皮毛光澤程度。

肝指數(shù):稱其體和肝的質(zhì)量，計(jì)算出肝/體質(zhì)量的比值，為其肝指數(shù)。

GSH－PX，MDA，SOD，F(xiàn)FA的測定:采用比色法對(duì)其血清測定上述指標(biāo)，測定步驟嚴(yán)格按照GSH－PX，MDA，SOD，F(xiàn)FA試劑盒說明書進(jìn)行。

病理學(xué)檢測:取肝臟左葉同樣部位的大小質(zhì)量一致的兩塊肝組織放入10%的甲醛中固定存放，并進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、HE染色、切片和光鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組與組之間比較采用單因素方差分析中的SNK法進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 雙葛解酲丸對(duì)肝指數(shù)和體質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)期間，除空白對(duì)照組大鼠以外，各組大鼠體質(zhì)量都有不同程度的降低，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，下降較為明顯，治療組體質(zhì)量相比模型對(duì)照組都有不同程度的增加。見表1。

表1 雙葛解酲丸對(duì)肝指數(shù)和體質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of Shuangge Jiecheng Pills on im provem ent of rat’s liver-index and weight in each group

2.2 肝組織病理改變?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中，模型對(duì)照組大鼠皮毛發(fā)黃光澤度差、體質(zhì)量明顯減輕，空白對(duì)照組大鼠皮毛光滑光澤度高，精神充沛。肉眼觀察模型對(duì)照組大鼠肝臟體積增大，顏色發(fā)黃白，邊緣變鈍，切面有油膩感，光鏡下可見空白對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常完整無形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞排列緊密成索狀，無變性壞死的炎癥細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞脂肪樣變性，僅在細(xì)胞間質(zhì)中有少量脂滴，但其模型對(duì)照組大量肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)有中大泡型的脂滴產(chǎn)生，肝細(xì)胞也有中度至重度的脂肪變性，并伴有炎癥細(xì)胞的浸潤，經(jīng)過藥物治療后，雙葛解酲丸高劑量組肝細(xì)胞脂肪樣變性和炎癥介質(zhì)的浸潤較模型對(duì)照組明顯減輕。雙葛解酲丸低劑量組、雙葛解酲丸中劑量組、海王金樽組也有不同程度的減輕，見圖1。按表2標(biāo)準(zhǔn)，光鏡檢查脂變程度。光鏡下檢查結(jié)果見表3。

圖1 HE染色肝細(xì)胞病理變化Fig.1 Photos of HE staining show ing the changes of the liver cells in alcoholic fatty liver disease rats in each group

表2 肝脂變程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Classification standard of liver steatosis degree

表3 對(duì)綜合因素致大鼠脂肪肝模型的預(yù)防作用肝臟病理光鏡檢查結(jié)果Tab.3 Light m icroscopic exam ination results of preventive effects on liver pathology of fatty liver rat model induced by comprehensive factors

2.3 雙葛解酲丸對(duì)大鼠血清MDA，SOD，GSH－PX的影響由表4～5可見，模型對(duì)照組大鼠血清MDA顯著高于正常組，GSH－PX和SOD顯著低于正常組(P＜0.01)，雙葛治療組大鼠血清MDA明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，GSH－PX和SOD顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05)。

表4 雙葛解酲丸對(duì)大鼠血清MDA、SOD的影響Tab.4 Effects of Shuangge Jiecheng Pills on improvement of rats’serum-MDA and serum-SOD in each group

表5 雙葛解酲丸對(duì)大鼠血清GSH-PX、FFA的影響Tab.5 Shuangge Jiecheng Pills on im provement of rats’serum-GSH-PX and serum-FFA in each group

3 討論

關(guān)于酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，近年來很多學(xué)者提出以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為核心的“二次打擊”假說［5］，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化在酒精性脂肪肝的形成與發(fā)展中起到了重要作用［6－7］。

游離脂肪酸被認(rèn)為是酒精性脂肪肝的重要的起始因子，是酒精性脂肪肝發(fā)生的關(guān)鍵性因素。游離脂肪酸可以直接損傷細(xì)胞質(zhì)、肝線粒體及溶酶體膜，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死和炎性介子的浸潤，線粒體腫脹和通透性加大。研究還認(rèn)為升高的FFA還減少胰島素消除并損害肝細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性，加重胰島素抵抗，F(xiàn)FA增多與細(xì)胞色素P450ⅡE1的高表達(dá)及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)有一定的聯(lián)系［8］。另外增加游離脂肪酸還可以導(dǎo)致胰島素血癥的產(chǎn)生，血中胰島素又促使脂肪的合成，抑制其分解，進(jìn)一步導(dǎo)致血脂的升高、肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積及肝細(xì)胞腫大，導(dǎo)致脂肪肝的形成。

本實(shí)驗(yàn)檢測了酒精性脂肪肝大鼠的血清SOD、GSH－PX活力和MDA，F(xiàn)FA含有量，模型對(duì)照組大鼠的MDA和FFA較正常組大鼠顯著升高，SOD、GSH－PX較正常組顯著降低，表明大量酒精攝入大鼠體內(nèi)，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)不斷的堆積，過量自由基與生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的MDA，從而破壞生物膜的正常功能和結(jié)構(gòu)，造成肝損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙葛解酲丸組和海王金樽組大鼠的血清SOD含有量和GSH－PX明顯高于模型對(duì)照組(P＜0.05)，MDA和FFA含有量明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，而雙葛解酲組的效果明顯好于海王金樽組。由此可見雙葛解酲丸可以明顯提高血清SOD和GSH－PX活力并減低血清中MDA和FFA，清除機(jī)體代謝產(chǎn)生的自由基，促使氧化與抗氧化機(jī)制恢復(fù)正常，消除炎癥反應(yīng)，阻斷自由基的放大效應(yīng)，使肝功和肝組織的病理學(xué)形態(tài)恢復(fù)正常，對(duì)酒精性脂肪肝具有良好的防治效果。

在祖國的古代醫(yī)籍中沒有提出酒精性脂肪肝的概念，結(jié)合其病因和病機(jī)的特點(diǎn)，現(xiàn)代學(xué)者一般將其歸于“酒疳”、“酒癖”等范疇。趙文霞等［9］指出，酒精性脂肪肝病機(jī)為本虛而標(biāo)實(shí)，本虛在脾、腎、肝虛，標(biāo)實(shí)在痰、瘀阻、濕等病理產(chǎn)物為主要病理因素。雙葛解酲丸以健脾化濕，發(fā)汗利水，疏肝理氣為組方原則，以葛花、枳椇子、葛根為其主藥，其中葛花其水提取通過增強(qiáng)乙醇脫氫酶活性來降低血液中乙醇，在乙醇的腸胃代謝與吸收兩個(gè)方面發(fā)揮重要作用，對(duì)酒精引起的肝細(xì)胞損傷變性有保護(hù)作用［10］，葛花是具有很好的透解之力，解酒醒神之佳品，研究表明口服葛花以及靜脈注射尼泊爾鶯尾素均可顯著減少血中的乙醇量，降低乙醇毒性可大幅度減少乙醇中毒大鼠血清ALT、AST［11］。枳椇子，其有清熱解毒、利尿解酒毒之功效?，F(xiàn)代研究表明，枳椇子可增強(qiáng)血中谷胱甘肽過氧化物酶的活性從而促進(jìn)乙醇的代謝［12］。

本實(shí)驗(yàn)研究從肝組織病理學(xué)、肝功能變化等方面證明，中藥復(fù)方雙葛解酲丸具有明顯的對(duì)抗酒精性脂肪肝的作用，海王金樽片是目前很常用的一種解酒藥，具有保肝護(hù)肝的作用，本實(shí)驗(yàn)中，雙葛解酲丸高劑量組對(duì)脂肪肝的效果明顯好于海王金樽組(P＜0.01)，說明雙葛解酲丸在大劑量的時(shí)候其作用優(yōu)于西藥海王金樽片，并且制作方便，價(jià)格便宜，如果能做成方便劑型，將對(duì)酒精性脂肪肝病的早期防治起到很良好的作用。

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