史高峰，祝娟娟，陳學福，王國英，陳英贊，蒲凌云

(蘭州理工大學石油化工學院，甘肅蘭州730050)

黃芩莖葉為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeogi的干燥莖葉［1］。傳統(tǒng)藥用部位為黃芩的根，地上莖葉部分被視為非藥用部分而被棄去，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、河南、山東、四川、云南、山西、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古等地。其主要有效成分野黃芩苷是對心腦血管起效的活性成分［2］，已被制成針劑、藥片、膠囊等多種劑型。目前此藥物急缺，國內(nèi)外市場已經(jīng)不能滿足，因此高純度的野黃芩苷有待大規(guī)模的開發(fā)。原野黃芩苷的制備主要是從燈盞花中得到［3-5］，現(xiàn)因燈盞花野生資源和種植面積不斷減少，且價格高，因此本實驗以黃芩莖葉為原料制備野黃芩苷，變廢為寶。從黃芩莖葉中制備野黃芩苷的傳統(tǒng)工藝［6-9］，主要是采用大孔樹脂或聚酰胺樹脂進行純化分離［10-12］，工藝繁瑣，工業(yè)化造價高。因此本實驗建立了一種新的制備方法，堿提酸沉法，對分離過程中影響分離效果的諸因素進行篩選，確定最佳的分離工藝，為黃芩莖葉綜合開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料黃芩莖葉粗提物，實驗室自制。

1.1.2 試劑對照品為野黃芩苷，純度98%，阿拉丁試劑(中國)有限公司，實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器U—2001紫外分光光度計，日本日立公司;ZK—82電熱真空干燥箱，上海市實驗儀器總廠;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RE—3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Surveyor高效液相色譜分析儀，美國Finnigan。

1.2 野黃芩苷的制備工藝流程見圖1。

圖1 野黃芩苷制備工藝流程

1.3 黃芩莖葉粗提物的制備準確稱取經(jīng)預(yù)處理的黃芩莖葉(粉碎)1 000.0 g，用12倍樣品質(zhì)量的70%的乙醇為提取溶劑，70℃提取2.5 h，重復提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，置烘箱內(nèi)60℃干燥，取出冷卻后稱定質(zhì)量，研細，作為黃芩莖葉粗提物，備用。

1.4 從粗提物中分離野黃芩苷影響因子考察

1.4.1 堿提pH的研究準確稱取黃芩莖葉粗提物4.0 g，5份，分別加入一定量的沸蒸餾水，攪拌并超聲溶解，用15%NaOH調(diào)pH至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。濾過，濾液加10%H2SO4，pH均調(diào)至1.5。靜置36 h，析出棕色沉淀物，傾取上層溶液，再次靜置24 h后，析出土黃色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黃色沉淀物，過濾，濾餅用蒸餾水，丙酮洗至中性，烘干，用紫外分光光度法檢測總黃酮的含有量。

1.4.2 酸沉pH研究準確稱取黃芩莖葉粗提物15.0 g，加入一定量沸蒸餾水，攪拌并超聲溶解，加入15%NaOH調(diào)pH至7.5，趁熱過濾，濾液分成5份，加10%硫酸調(diào)pH至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，靜置36 h，析出棕色沉淀物，傾取上層溶液，再次靜置24 h后，析出棕黃色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黃色沉淀物，過濾，濾餅用蒸餾水，丙酮洗至中性，烘干用紫外分光光度法檢測總黃酮的含有量。

1.4.3 料液比的研究準確稱取等量的黃芩莖葉粗提物，分別按料液比(m∶V)1∶5、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入沸蒸餾水，攪拌并超聲使溶解，緩緩加入15%氫氧化鈉溶液，調(diào)pH至約7.5，趁熱濾過，濾液緩緩加入10%H2SO4溶液，調(diào)pH至0.5。靜置36 h，析出棕色沉淀物，傾取上層溶液，再次靜置24h后，析出土黃色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黃色沉淀物，過濾，濾餅用蒸餾水，丙酮洗至中性，烘干，用紫外分光光度法檢測總黃酮的含有量。

1.5 黃芩莖葉粗提物中總黃酮的測定以野黃芩苷為對照品，采用紫外分光光度法測定單因素試驗所得沉淀物中總黃酮。

1.5.1 測定波長的確定取野黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解，稀釋至一定刻度，置紫外/可見分光光度儀中，在200～600 nm掃描，繪制紫外吸收光譜。結(jié)果表明野黃芩苷在335 nm處有最大吸收，因此，將測定波長定為335 nm［13］。

1.5.2 標準曲線的制定精密稱取野黃芩苷對照品2.5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL量瓶，搖勻得質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的野黃芩苷對照品溶液。分別吸取上述野黃芩苷對照品溶液1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL.定容于10 mL量瓶中，在波長335 nm處測量吸光度(A)，以對照品質(zhì)量濃度(C，mg/mL)為橫坐標，以A為縱坐標，得標準曲線A=46.154C－0.017，R2=0.999 8。

1.6 野黃芩苷定性定量分析HPLC條件:色譜柱為Hypersil Gold C18柱(2.1 mm×150 mm，Agilet);流動相為甲醇-0.05%的H3PO4溶液為40∶60［14］;進樣室溫度:30℃，柱溫:40℃;檢測波長:335 nm;體積流量:0.2 mL/min;進樣量5 μL。

實驗所得樣品的檢測精密稱取野黃芩苷樣品2.8 mg，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL，即0.1 mg/mL，取此樣品1.0 μL進樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野黃芩苷分離影響因子考察

2.1.1 堿提pH的研究不同堿提pH對黃芩莖葉總黃酮質(zhì)量分數(shù)和浸膏得率的影響，見圖2。

圖2 堿提pH對黃芩莖葉浸膏得率和總黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖2可知:在一定的pH范圍內(nèi)，黃芩莖葉浸膏得率及總黃酮質(zhì)量分數(shù)隨著pH的升高，而逐漸提高。當pH達到7.5左右時，浸膏得率及總黃酮質(zhì)量分數(shù)達到最大。pH繼續(xù)升高，浸膏得率和總黃酮質(zhì)量分數(shù)呈降低趨勢，考慮到過高的pH會使野黃芩苷結(jié)構(gòu)上的葡萄糖基水解，因此，堿提pH選用7.5為宜。

2.1.2 酸沉pH研究不同酸沉pH對黃芩莖葉總黃酮含有量和浸膏得率的影響，見圖3。

圖3 酸沉pH值對黃芩莖葉浸膏的率和總黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖3可知:隨著pH的增大，浸膏得率及總黃酮含有量逐漸降低，當pH為2.5時沒有沉淀生成。但在pH為0.5時，酸沉得效果最好，浸膏得率及總黃酮含有量為最高。因此，酸沉pH選用0.5較為適宜。

2.1.3 料液比的研究不同料液比對黃芩莖葉總黃酮含有量和浸膏得率的影響，見圖4。

圖4 固液比對黃芩莖葉浸膏的率和總黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響

由圖4可知:在料液比為1∶5～1∶12的范圍內(nèi)，浸膏得率及總黃酮含有量隨著料液比的增大，而逐漸提高。當料液比超過1∶12后，料液比繼續(xù)增大，對浸膏得率和總黃酮含有量沒有顯著提高。因此，考慮成本，料液比選用1∶12為宜。

2.2 HPLC檢測野黃芩苷樣品色譜圖見圖5，6。經(jīng)色譜分析得知:野黃芩苷標準品的保留時間為3.74 min，實驗室自制野黃芩苷樣品保留時間為3.78 min，其保留時間基本相近，同時樣品野黃芩苷色譜峰所對應(yīng)的紫外吸收波長為335 nm，與文獻值相近［14］。經(jīng)樣品的色譜峰面積計算野黃芩苷質(zhì)量分數(shù)達93.7%。

2.3 驗證試驗準確稱取一定量的黃芩莖葉粗提物，按料液比1∶12，堿提pH 7.5，酸沉pH 0.5的條件驗證試驗。結(jié)果黃芩莖葉浸膏得率平均為3.48%，總黃酮質(zhì)量分數(shù)平均值為92.3%，野黃芩苷平均質(zhì)量分數(shù)為92.13%。驗證結(jié)果見表1。

圖5 野黃芩苷標準品HPLC色譜圖

圖6 實驗室自制野黃芩苷樣品HPLC色譜圖

表1 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)堿提酸沉法確定黃芩莖葉粗提物中分離野黃芩苷的最佳參數(shù)為:堿提pH為7.5，酸沉pH為0.5，所得沉淀中總黃酮質(zhì)量分數(shù)80%以上，所得沉淀用甲醇溶劑法重結(jié)晶，經(jīng)HPLC檢測，質(zhì)量分數(shù)為93.7%。

該制備工藝具有操作簡單，生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為黃芩莖葉的進一步開發(fā)打下了良好基礎(chǔ)。

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