李光民 葛鵬飛 孟繁凱 楊 穎 王光明 羅毅男 (吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 3002)

缺血后處理對(duì)大鼠缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶的影響

李光民 葛鵬飛1孟繁凱 楊 穎1王光明1羅毅男1(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討缺血后處理對(duì)短暫腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶的影響。方法 采用大鼠全腦缺血模型。Wistar大鼠分為缺血組及缺血后處理組，每組按照再灌注時(shí)間進(jìn)一步分為12 h恢復(fù)組、24 h恢復(fù)組、48 h恢復(fù)組及72 h恢復(fù)組。采用HE染色光鏡觀察腦缺血后神經(jīng)元死亡;差速離心結(jié)合蛋白印跡分析短暫腦缺血后蛋白伴侶hsp70和hsp40在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量的變化。結(jié)果 HE染色顯示缺血后處理顯著降低了腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡;蛋白印跡分析顯示，缺血后處理顯著提高了hsp70的表達(dá)，同時(shí)還降低了缺血再灌注所致的hsp40的減少。結(jié)論

缺血后處理能夠顯著減少腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)hsp70和hsp40的含量，進(jìn)而抑制蛋白聚集物的形成，降低了缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡。

缺血后處理;腦缺血再灌注;蛋白伴侶hsp70;蛋白伴侶hsp40

缺血后處理是指在腦缺血結(jié)束后，反復(fù)地間斷性阻斷腦血流的恢復(fù)，進(jìn)而達(dá)到腦保護(hù)的目的〔1〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注所致的神經(jīng)元延遲性死亡的保護(hù)作用與其能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)〔2〕，但是其對(duì)腦缺血再灌注過(guò)程中蛋白伴侶的影響尚不清楚。蛋白伴侶是一類(lèi)功能上相互關(guān)聯(lián)，具有輔助蛋白質(zhì)折疊作用的一類(lèi)特殊蛋白質(zhì)，可以防止或抑制不具有正常結(jié)構(gòu)的蛋白彼此聚集在一起形成細(xì)胞毒性作用的蛋白聚集物〔3〕，而蛋白聚集物被認(rèn)為是導(dǎo)致腦缺血后神經(jīng)元死亡的重要病理基礎(chǔ)之一〔4〕。本研究采用大鼠全腦缺血模型，探討缺血后處理對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性 Wistar大鼠，280～320 g，80只，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。分為腦缺血組、后處理組;每組又分為假手術(shù)組，12 h恢復(fù)組，24 h恢復(fù)組，48 h恢復(fù)組及72 h恢復(fù)組。每組8只，其中4只用于蛋白印跡分析，4只用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 抗熱休克蛋白70(hsp70)及hsp40多克隆抗體(美國(guó)Cell signaling公司)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)，ECL(美國(guó)Amersham公司)，其他試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司)，膠片(美國(guó)Kodak公司)。電泳槽及電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。激光掃描共聚焦顯微鏡為德國(guó)產(chǎn)Zeiss LSM 510型;震動(dòng)切片機(jī)為德國(guó)產(chǎn)Leica VT-1000S型。

1.2 方法

1.2.1 全腦缺血模型的制作 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈暫時(shí)夾閉法。動(dòng)物禁食一夜，隨意飲水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷誘導(dǎo)麻醉，然后以2%濃度維持麻醉。尾動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，同時(shí)注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右側(cè)股動(dòng)脈插管備用。頸部正中直切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。顳肌下和直腸內(nèi)分別插入熱敏探頭，監(jiān)測(cè)頭溫和體溫;手術(shù)過(guò)程中用恒溫毯將頭溫和體溫保持在36.8℃ ～37.2℃。缺血時(shí)先用動(dòng)脈瘤夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)股動(dòng)脈抽血將動(dòng)脈壓降至50 mmHg后再進(jìn)行缺血，缺血時(shí)間為15 min。缺血結(jié)束后，除去動(dòng)脈瘤夾并將血液回輸。

1.2.2 缺血后處理方法 腦缺血結(jié)束后，松開(kāi)動(dòng)脈瘤夾恢復(fù)腦供血30 s，再夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷腦供血30 s;如此反復(fù)，3個(gè)循環(huán)后完全解除頸動(dòng)脈夾閉，徹底恢復(fù)腦供血。

1.2.3 腦組織固定 將大鼠麻醉、氣管插管后連接呼吸機(jī)，以3%氟烷維持麻醉，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，左心室內(nèi)注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，將導(dǎo)管經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈，先以4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的PBS液灌注3 min，取出腦組織，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。

1.2.4 HE染色 將載有腦片的載玻片放置于背光處陰干，用梯度乙醇溶液脫水后置于蘇木素溶液中15 s，沖洗干凈后，放入Scott溶液中10 s，沖洗后放入伊紅溶液中10 s，再經(jīng)乙醇溶液脫水后進(jìn)行透明處理，加蓋玻片。在高倍顯微鏡下選擇海馬CA1區(qū)進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)存活的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 胞質(zhì)蛋白組分的分離 大鼠麻醉后，迅速斷頭，分離海馬CA1區(qū)腦組織，液氮冷凍保存。將腦組織稱(chēng)重后，按照重量體積比1∶10加入勻漿緩沖液〔1.5 mmol/L Tris-HCl pH7.6，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L MgCl2，1.25 μg/ml pepstatin A，10 μg/mlleupeptin，2.5 μg/mlaproptonin，0.5 mmol/L PMSF，2.5mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，0.1 mol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF，2 mmol/L 焦磷酸鈉〕，勻漿器抽壓35次。勻漿組織液以4℃ 6 500 r/min離心20 min，抽取上清用于分離胞質(zhì)蛋白組分(分離條件為4℃ 75 000 r/min離心1 h，上清即為含有胞質(zhì)蛋白的組分)。Bradford法測(cè)定含有胞質(zhì)蛋白組分的蛋白濃度后，保存于－20℃冰箱備用。

1.2.6 蛋白印跡分析 十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。0.45 μm PVDF膜濕法電轉(zhuǎn)膜。室溫下3%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。置于搖床上與抗hsp40多克隆抗體4℃下孵育過(guò)夜。室溫下與二抗孵育1 h。再與化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)一起孵育1 min，然后經(jīng)過(guò)曝光，顯影，沖洗，定影等步驟。用Kodak ID軟件測(cè)定每一個(gè)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理具有保護(hù)短暫腦缺血后神經(jīng)元延遲性死亡的作用

HE染色顯示缺血再灌注后72 h，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元幾乎全部死亡，死亡的神經(jīng)元胞質(zhì)粉染，胞核固縮深染，呈現(xiàn)多角形。然而缺血后處理組則有部分神經(jīng)元存活。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，缺血組僅有5.21%±1.21%的神經(jīng)元存活;而后處理組存活的神經(jīng)元?jiǎng)t高達(dá)55.32% ±5.34%，二者之間差異顯著(P＜0.01)。

2.2 缺血后處理能夠顯著提高蛋白伴侶hsp70的表達(dá)

蛋白印跡分析顯示，缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶hsp70的表達(dá)在再灌注后12 h、24 h和48呈顯著提高;但是，缺血后處理能夠進(jìn)一步提高使海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶hsp70的表達(dá)，二組之間具有顯著性差異。

2.3 蛋白伴侶hsp40在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含量的變化

蛋白印跡分析顯示：缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶hsp40的含量在再灌注后24 h和48 h顯著下降;相比之下，缺血后處理減少了hsp40的下降，兩組之間具有顯著性差異。

3 討論

對(duì)于蛋白聚集物形成的機(jī)制，目前較普遍的觀點(diǎn)是，細(xì)胞受到應(yīng)激刺激后，一方面細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊;另一方面，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生解鏈而變性〔5〕。這兩類(lèi)異常蛋白質(zhì)都不具有正常的空間結(jié)構(gòu)，使本應(yīng)該位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水集團(tuán)暴露在外面，這些具有黏性的疏水基團(tuán)彼此粘連在一起形成細(xì)胞毒作用的蛋白聚集物〔6〕。蛋白聚集物可以沉積在胞質(zhì)中，也可以黏附在線粒體和高爾基體等膜性細(xì)胞器上，影響細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔7〕。

細(xì)胞內(nèi)每時(shí)每刻都有異常蛋白生成，但細(xì)胞內(nèi)并不形成蛋白聚集物，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)存在蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)能夠監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)形成的異常蛋白，并及時(shí)地將其清除掉〔8〕。蛋白伴侶是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)的重要組成部分，能夠輔助蛋白質(zhì)的折疊、促進(jìn)其降解、抑制蛋白聚集物的形成。在蛋白伴侶中，hsp70是可誘導(dǎo)的蛋白伴侶，主要位于胞質(zhì)中，能夠識(shí)別并與新合成的、部分折疊的以及解鏈的蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)它們的折疊或者降解〔9〕。Hsp40具有三方面的作用：①能夠與異常蛋白上的疏水基團(tuán)相結(jié)合防止形成蛋白聚集物〔10〕;②能夠與hsp70協(xié)同作用，將異常蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白降解系統(tǒng)，如蛋白酶體〔11〕;③能夠調(diào)節(jié)hsp70的功能，具有輔助和增強(qiáng)hsp70的作用〔12〕。

本研究結(jié)果顯示，缺血后處理的腦保護(hù)作用與其能夠調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)蛋白伴侶hsp70和hsp40的含量有密切的關(guān)系。作為應(yīng)激性蛋白伴侶，hsp70在腦缺血再灌注過(guò)程中雖然有顯著性表達(dá)，但是由于hsp40在再灌注后24 h和48 h顯著性減少，導(dǎo)致二者不能協(xié)調(diào)發(fā)揮抑制蛋白聚集物形成的作用。與出血組比較，缺血后處理不僅能夠顯著提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶hsp70的表達(dá)，還能保持腦缺血后蛋白伴侶hsp40在神經(jīng)元的含量，進(jìn)而促進(jìn)了hsp70和hsp40的協(xié)同作用，增強(qiáng)了其對(duì)蛋白聚集物形成的抑制作用，發(fā)揮了腦保護(hù)作用。

綜上所述，缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用與其能夠改善蛋白伴侶hsp70和hsp40在神經(jīng)元內(nèi)的含量有密切關(guān)系。這為缺血后處理的腦保護(hù)作用提供了一個(gè)新的機(jī)制。

1 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy：ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2006;26(9)：1114-21.

2 Zhou C，Tu J，Zhang Q，et al.Delayed ischemic postconditioning protects hippocampal CA1 neurons by preserving mitochondrial integrity via Akt/GSK3β signaling〔J〕.Neurochem Int，2011;59(5)：749-58.

3 Ge P，Luo Y，Wang H，et al.Anti-protein aggregation is a potential target for preventing delayed neuronal death after transient ischemia〔J〕.Med Hypotheses，2009;73(6)：994-5.

4 Ohtsuka K，Hata M.Molecular chaperone function of mammalian Hsp70 and Hsp40-a review〔J〕.Int J Hyperthermia，2000;16(3)：231-45.

5 Marciniak SJ，Ron D.Endoplasmic reticulum stress signaling in disease〔J〕.Physiol Rev，2006;86(4)：1133-49.

6 Stefani M，Dobson CM.Protein aggregation and aggregate toxicity：new insights into protein folding，misfolding diseases and biological evolution〔J〕.J Mol Med，2003;81(11)：678-99.

7 Grune T，Jung T，Merker K，et al.Decreased proteolysis caused by protein aggregates，inclusion bodies，plaques，lipofuscin，ceroid and aggresomes during oxidative stress，aging and disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004;36：2519-30.

8 10 Nishikawa S，Brodsky JL，Nakatsukasa K.Roles of molecular chaperones in endoplasmic reticulum(ER)quality control and ER-associated degradation(ERAD)〔J〕.J Biochem(Tokyo)，2005;137(5)：551-5.

9 Laskowska E，Matuszewska E，Kuczyńska-Wisnik D.Small heat shock proteins and protein-misfolding diseases〔J〕.Curr Pharm Biotechnol，2010;11(2)：146-57.

10 Hartl FU，Hayer-Hartl M.Molecular chaperones in the cytosol：from nascent chain to folded protein〔J〕.Science，2002;295(5561)：1852-8.

11 Bukau B，Weissman J，Horwich A.Molecular chaperones and protein quality control〔J〕.Cell，2006;125(5)：443-51.

12 Evans CG，Wisén S，Gestwicki JE.Heat shock proteins 70 and 90 inhibit early stages of amyloid beta-(1-42)aggregation in vitro〔J〕.J Biol Chem，2006;281(44)：33182-91.

The effects of ischemic postconditioning on chaperones in the CA1 neurons suffered transient ischemia and reperfusion

LI Guang-Min，GE Peng-Fei，MENG Fan-Kai，et al.
Jilin Province People's Hospital，Changchun 130021，Jilin，China

Objective To investigate the effects of ischemic postconditioning on the chaperones in the CA1 neurons suffered transient ischemia and reperfusion.Methods Transient global ischemia rat model was established.Following different reperfusion period，all the Wistar rats were divided into ischemia and ischemic postconditioning groups.Each group was divided further into sham-operation，12，24，48 and 72 h recovery groups.Differential centrifuge and Western blotting analysis were used to analyze the quantitative alterations of hsp40 and hsp70.Results HE staining showed that ischemic postconditioning reduced neuronal death induced by transient ischemia and reperfusion.Western blotting analysis showed that the expression of hsp70 was upregulated，and the content of hsp40 in CA1 neurons was improved by ischemic postconditioning.Conclusions Ischemic postconditioning could improve the quantities of hsp70 and hsp40 in the CA1 neurons，and reduce neuronal death in the CA1 region caused by ischemia and reperfusion.

Ischemic postconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Chaperone hsp70;Chaperone hsp40

R749

〕 A

〕 1005-9202(2012)22-4936-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.038

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30973110);吉林省科技廳資助項(xiàng)目(No.200805122)

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科

楊 穎(1984-)，男，在讀碩士，主要從事腦膠質(zhì)瘤的外科治療研究。

李光民(1955-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病機(jī)制及外科治療研究。

〔2012-01-10收稿 2012-02-16修回〕

(編輯 袁左鳴)