郭 輝， 胡 晨， 錢俊青， 李 宏， 岳昌林

(1.浙江九旭藥業(yè)有限公司，浙江金華321016;2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014)

鴉膽子又名老鴉膽 Brucea javanica(L．)Merr．，苦參子。性寒，味苦，有小毒，歸大腸和肝經(jīng)。中醫(yī)以其清熱解毒、截瘧、止痢，腐蝕贅疣等功效，一般用于熱性赤痢、便血、瘧疾、雞眼及疣等治療，為《中華人民共和國(guó)藥典》收載品種［1-3］。鴉膽子中含有20%左右的脂肪油類成分，即鴉膽子油。七十年代以來(lái)許多研究表明鴉膽子油是一種療效確切的新型廣譜抗腫瘤藥，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，用于消化道腫瘤、肺癌及宮頸癌等的治療［4-6］。鴉膽子油的主要成分是甘油三酸酯，相關(guān)文獻(xiàn)采用GC分析鴉膽子油中甘油三酯的脂肪酸成分，表明鴉膽子中的脂肪酸主要是油酸、亞油酸、亞麻酸、軟脂酸和硬脂酸［7］，活性成分主要是油酸和亞油酸。目前，在鴉膽子油的質(zhì)量控制中一般采用GC方法分析控制脂肪酸成分［8-9］，這套分析評(píng)價(jià)方法中，對(duì)鴉膽子油中原有甘油三酸酯類成分先進(jìn)行水解，然后再進(jìn)一步甲酯化確定成分，過(guò)程檢測(cè)的是鴉膽子油水解產(chǎn)物脂肪酸，同時(shí)由于氣相操作溫度過(guò)高，原有一些不飽和脂肪酸類成分容易氧化。另一方面由于甘油三酯在紫外區(qū)基本無(wú)吸收，當(dāng)前采用HPLC方法分析鴉膽子油一般是采用柱前衍生化的方法，將其水解成脂肪酸再對(duì)其進(jìn)行酯化使其產(chǎn)生紫外吸收進(jìn)行分析［10-11］，該衍生化過(guò)程操作繁瑣。而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)無(wú)紫外吸收的成分能夠提供較好的檢測(cè)結(jié)果，國(guó)內(nèi)外一些相關(guān)的研究表明蒸發(fā)光檢測(cè)器對(duì)于油脂類成分分析檢測(cè)有較好的響應(yīng)結(jié)果［12-13］。本實(shí)驗(yàn)建立 HPLCELSD特征指紋圖譜方法，為有效控制和科學(xué)評(píng)價(jià)鴉膽子油的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，配chemstation色譜工作站，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱);Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;Agilent 6210 LC/TOF液質(zhì)聯(lián)用儀;Sartorius電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);HWS24型電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科技有限公司);R—201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海申生科技有限公司);正己烷、異丙醇 (色譜級(jí)，天津博迪化工有限公司);乙腈、甲醇 (色譜級(jí)，默克公司)。

1.2 試藥 鴉膽子 (浙江九旭藥業(yè)有限公司提供)批號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1;三油酸甘油酯對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111692-200501)。

表1 鴉膽子油批號(hào)及來(lái)源Tab.1 Batches and sources of Brucea javanica oil

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相為66%乙腈，20%異丙醇，14%正己烷;體積流量1.0 mL/min;蒸發(fā)光檢測(cè)器，檢測(cè)溫度70℃;載氣流量1.5 mL/min;進(jìn)樣量 2 μL。

2.2 對(duì)照溶液的制備 取三油酸甘油酯對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為3.019 mg/mL的對(duì)照品溶液，冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 取鴉膽子粗粉約3 g，精密稱定，加入石油醚 (60～90℃)30 mL，超聲處理 (功率280 W，頻率42 Hz)30 min，濾過(guò)，濾液置50 mL量瓶中，用石油醚 (60～90℃)30 mL，分次洗滌濾器和濾渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去溶劑，獲得鴉膽子油。取0.1 g鴉膽子油溶于異丙醇中，并定容至10 mL。0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液6份，按2.3項(xiàng)下操作制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣，測(cè)得其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20100101批次藥材，制備成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品測(cè)定 取10批鴉膽子樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下依次進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，共獲得9個(gè)共有峰。典型鴉膽子油色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 鴉膽子油色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Brucea javanica oil

2.6 特征指紋圖譜的建立

2.6.1 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中三油酸甘油酯的色譜峰 (6號(hào)峰)峰位居中，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定三油酸甘油酯為參照峰。以其保留時(shí)間和峰面積為1.0，計(jì)算各批指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.6.2 特征指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將所得的10批鴉膽子油HPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》軟件 (2004年A版)，以S1批藥材譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配，建立了共有模式見(jiàn)圖2。相似度分析見(jiàn)表2。

圖2 10批鴉膽子油HPLC特征指紋圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of 10 batches of Brucea javanica oil

表2 鴉膽子油指紋圖譜相似性分析Tab.2 Results of 10 batches of Brucea javanica oil sample similarity

2.7 HPLC-MS分析 采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)鴉膽子的化學(xué)成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測(cè)。結(jié)構(gòu)鑒定依據(jù)是:APCI質(zhì)譜中甘油三酸酯裂解成甘油二酸酯，裂解出來(lái)的甘油二酸酯相對(duì)豐度會(huì)存在一定差異，一般在APCI質(zhì)譜中存在分子離子峰以及一些裂解單脂肪酸的甘油二酸酯峰，而這些甘油二酸酯［M+H·RiCOOH］+的相對(duì)豐度可以說(shuō)明脂肪酸是否處于sn-2位置，甘油三酸酯在sn-2位置裂解出脂肪的離子碎片 ［M+H·R2COOH］+，需要更大能量，可能性較?。?4-16］。由此結(jié)合分子量和相對(duì)豐度，指認(rèn)出油酸亞麻酸亞油酸甘油酯 (1號(hào)峰)、1，2-二亞油酸-3-油酸甘油酯 (2號(hào)峰)、1，2-二亞油酸-3-軟脂酸甘油酯 (3號(hào)峰)、1，3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 (4號(hào)峰)、油酸亞油酸軟脂酸甘油酯 (5號(hào)峰)、三油酸甘油酯 (6號(hào)峰)、軟脂酸亞油酸硬脂酸甘油酯 (8號(hào)峰)和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯 (9號(hào)峰)。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 根據(jù)制備工藝及樣品的理化性質(zhì)，選用石油醚 (60～90℃)為提取溶劑，采用索氏提取、回流提取、超聲提取等提取方式分別提取樣品進(jìn)行考察，結(jié)果幾種方法提取所得樣品各成分基本無(wú)差別，為簡(jiǎn)便及降低成本和節(jié)約時(shí)間，采用超聲法進(jìn)行提取。

表3 HPLC-MS分析結(jié)果Tab.3 Result of HPLC-MS analysis

3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了三氯甲烷-乙腈、三氯甲烷-正己烷-乙腈、異丙醇-甲醇-乙腈、異丙醇-三氯甲烷-乙腈、正己烷-異丙醇-乙腈5個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用正己烷-異丙醇-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析，因此最終采用正己烷-異丙醇-乙腈系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 色譜柱的選擇 考察了相同色譜條件下采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-Phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等色譜柱對(duì)鴉膽子油分離結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，使用 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，鴉膽子油中各成分分離度高，色譜峰尖銳，峰形較好，分離時(shí)間較短。

3.4 蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)溫度的選擇 考察了相同色譜條件下蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)溫度為50℃、60℃、70℃時(shí)對(duì)鴉膽子油分離結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，50、60℃條件下基線噪音比較大，70℃效果較好。

3.5 指紋圖譜評(píng)價(jià) 對(duì)采自海南、廣州、佛山、深圳、廈門的10批鴉膽子油進(jìn)行了指紋圖譜分析，不同產(chǎn)地、批次鴉膽子油中主要成分的量略有差異，但指紋圖譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，經(jīng)相似度計(jì)算，10批樣品指紋圖譜相似度均在0.996以上，不同產(chǎn)地、批次的鴉膽子油指紋圖譜無(wú)顯著性差異。

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