鄭穎 王剛陽(yáng) 陳瑞玲 華瑩奇 蔡鄭東

. 臨床研究與實(shí)踐 Clinical research and practice .

探討鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡與自噬的作用

鄭穎 王剛陽(yáng) 陳瑞玲 華瑩奇 蔡鄭東

目的探討鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞 ( 143B HOS ) 增殖，骨肉瘤細(xì)胞凋亡與自噬的作用。方法用 CCK8 實(shí)驗(yàn)觀察鴉膽子素 D 對(duì) 143B HOS 增殖的影響；用平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察鴉膽子素 D 對(duì) 143B HOS細(xì)胞集落形成的影響；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鴉膽子素 D 對(duì) 143B HOS 周期阻滯以及誘導(dǎo)凋亡的作用情況；用Western Blot 檢測(cè) 143B HOS 基礎(chǔ)凋亡與自噬以及經(jīng)鴉膽子素 D 誘導(dǎo)之后的凋亡與自噬情況；用熒光顯微鏡檢測(cè) 143B 細(xì)胞基礎(chǔ) LC3 熒光鼬合蛋白表達(dá)以及經(jīng)鴉膽子素 D 誘導(dǎo)之后的 LC3 熒光鼬合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果( 1 ) CCK8 實(shí)驗(yàn)顯示鴉膽子素 D 作用后 143B HOS 細(xì)胞的存活率下降，同時(shí)，也減少了 143B HOS 細(xì)胞克隆數(shù)的形成；( 2 ) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示鴉膽子素 D 使 143B HOS 的 G0 / G1 期細(xì)胞比例增高；( 3 ) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，鴉膽子素 D 使 143B HOS 的細(xì)胞凋亡比例增加；Western Blot 檢測(cè) 143B HOS 細(xì)胞Cleaved PARP 的表達(dá)，結(jié)果顯示，鴉膽子素 D 誘導(dǎo) Cleaved PARP 表達(dá)增加；( 4 ) Western Blot 檢測(cè) 143B HOS細(xì)胞 LC3B 的表達(dá)，結(jié)果顯示，鴉膽子素 D 誘導(dǎo) LC3B-II 的表達(dá)增加；熒光顯微鏡檢測(cè) 143B 細(xì)胞的 LC3 熒光鼬合蛋白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，鴉膽子素 D 誘導(dǎo) 143B 細(xì)胞綠色熒光斑點(diǎn)生成增多。結(jié)論( 1 ) 鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖；( 2 ) 鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡；( 3 ) 鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬。

骨肉瘤；鴉膽子素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；自噬

骨肉瘤是臨床最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，以10～20 歲青少年發(fā)病居多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年每 100 萬(wàn)0～20 歲的人群中就有約 4～5 人發(fā)病[1]。好發(fā)部位為股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端以及肱骨近端的干骺端。約80% 患者死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中多為肺轉(zhuǎn)移。針對(duì)轉(zhuǎn)移患者治療方法有限，已發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的生存率在近幾十年里并沒(méi)有顯著提高[2]。研究表明：新輔助化療下的外科手術(shù)治療是目前骨肉瘤的主要治療方法[3]。手術(shù)前化療效果 ( 使用 Huvos 分級(jí)進(jìn)行評(píng)分 )，是骨肉瘤患者預(yù)后好壞的關(guān)鍵因素[4]。在最近 20 年里，隨著新型化療藥物的應(yīng)用，使得骨肉瘤的 5 年生存率從不足 20% 提高至 65%～75%。盡管臨床中已取得較大進(jìn)步，現(xiàn)今仍有超過(guò) 30%～40%的患者即便是在采用高強(qiáng)度化療后仍得不到有效治療[5]。因此，開發(fā)出更為有效，毒副作用相對(duì)低的化療藥物不失為提高患者生存率的可行之策。

鴉膽子是一種中藥植物，鴉膽子素 D ( Bruceine D ) 是從鴉膽子中分離提取出來(lái)的一種化合物。研究表明，鴉膽子素 D 對(duì)肝癌細(xì)胞[6]、胰腺癌細(xì)胞[7]等均有不同程度的抑制作用。但其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用尚未見報(bào)道。為了研究鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用，筆者選取了 143B HOS 兩個(gè)細(xì)胞系作為研究對(duì)象，使用 CCK8 實(shí)驗(yàn)與平板克隆實(shí) 驗(yàn)研究不同物質(zhì)量濃度下，鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用效果。同時(shí)，使用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)不同物質(zhì)量濃度下的鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的周期及誘導(dǎo)凋亡的作用；使用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)，探討鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

細(xì)胞分子生物學(xué)體外實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)于 2016 年 6～12 月在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院上海市骨腫瘤研究所完成。

二、實(shí)驗(yàn)材料

人骨肉瘤細(xì)胞株 143B HOS 購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心 ( ATCC )。鴉膽子素 D ( 分析標(biāo)準(zhǔn)品；純度HPLC＞98%，貨號(hào) B21415 -20 mg，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司 ) 將其溶于二甲基亞砜中，配置成 20 mmol / L 的工作母液，置于 -20 ℃ 的冰箱中備用，使用前用 DMEM 血清培養(yǎng)液調(diào)至所需濃度。DMEM 高糖培養(yǎng)基，胎牛血清 ( 美國(guó) Thermo 公司 )；Cleaved PARP 抗體，LC3B 抗體，GAPDH 抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 ( 斯信生物科技有限公司 )；二甲基亞砜 ( 美國(guó) Sigma 公司 )；0.02% EDTA＋0.25% 胰蛋白酶 ( 德國(guó) Miltenyi Biotec 公司 )；恒溫培養(yǎng)箱 ( 上海茸研儀器公司 )；流式細(xì)胞儀 ( 美國(guó) Becton Dickinson 公司 )；多功能酶標(biāo)儀 ( 美國(guó) Molecular Devices 公司 )；DMI3000B 熒光顯微鏡( 德國(guó) Leica 公司 )。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將骨肉瘤細(xì)胞株 143B HOS 培養(yǎng)在 DMEM 完全培養(yǎng)液中 ( 含有體積分?jǐn)?shù)為 10% 胎牛血清、0.1 g / L 鏈霉素、100 U / ml 青霉素 )，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到 85% 左右時(shí)，用 0.02% EDTA＋0.25% 胰蛋白酶混合消化液進(jìn)行消化，然后收集細(xì)胞 600 g 離心 3 min，傳代培養(yǎng)。

2. CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 143B HOS 細(xì)胞，PBS 清洗，計(jì)數(shù)，分管，按3000 個(gè) / 孔細(xì)胞數(shù)加入 96 孔板中，培養(yǎng) 24 h 使細(xì)胞貼壁，之后加入不同物質(zhì)的量濃度鴉膽子素 D ( 0，0.25，0.5，1，2，4 μM ) 進(jìn)行培養(yǎng) 24 h，然后進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入用 DMEM 培養(yǎng)基稀釋 10 倍的 CCK8試劑 100 μl 于 37 ℃ 孵育 45 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在 450 nm 處的吸光度值。

3. 平板克隆實(shí)驗(yàn)：用不同物質(zhì)的量濃度的鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 對(duì) 143B HOS 細(xì)胞進(jìn)行處理，作用 24 h 后吸去上層液體，用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，用 0.1% 結(jié)晶紫染色10 min，PBS 漂洗 2 次，風(fēng)干后拍照。

4. 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白：分別提取用含 0，1，2，4 μM 不同濃度鴉膽子素 D 培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h 的 143B HOS 細(xì)胞中的總蛋白，檢測(cè)凋亡蛋白 Cleaved PARP 和自噬蛋白 LC3B的表達(dá)，進(jìn)行定量，然后使用 10% 的分離膠進(jìn)行電泳。在冰浴下 100 V 轉(zhuǎn)膜 1 h。使用 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，加入相對(duì)應(yīng)的一抗 ( Cleaved PARP 抗體，LC3B 抗體和內(nèi)參蛋白 GAPDH 抗體 ) 4 ℃ 孵育過(guò)夜，采用 TBST 進(jìn)行洗滌 3 次，每次 10 min。之后加入二抗，37 ℃ 孵育 1 h，使用 TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，在暗室中壓片，然后進(jìn)行顯影、定影。

5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：將 143B HOS 細(xì)胞加入到含有不同物質(zhì)的量濃度鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞，600 g 離心 1 min PBS 清洗。用 70% 乙醇固定，加入周期試劑盒 PI 染液，室溫避光孵育 15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。圖像使用 ModFit 軟件進(jìn)行分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次。

6. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將 143B HOS 細(xì)胞加入到含有不同物質(zhì)的量濃度鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞，600 g 離心 1 min，PBS 清洗。然后使用 Annexin-VFITC / PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其凋亡情況，將細(xì)胞加入到 100 μl 1×Binding 緩沖液中重懸，添加 5 μl Annexin V-FITC 和 2.5 μl PI 染料，進(jìn)行避光振蕩混勻，室溫反應(yīng) 15 min，然后再加入 300 μl 1×Binding 緩沖液，混勻，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)試驗(yàn) 3 次。

7. LC3 熒光鼬合蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：將 GFP-LC3 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 143B 細(xì)胞內(nèi)，隨后使用不含鴉膽子素D 和含有 2 μM 鴉膽子素 D 的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染成功后的143B 細(xì)胞作用 24 h。之后使用 PBS 清洗 2 次，使用4% 多聚甲醛固定 20 min，使用 0.1% Triton X-100 通透化處理，用 DAPI 作用 15 min，最后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

四、觀察指標(biāo)

不同物質(zhì)的量濃度鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及自噬的影響。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用 x-±s 表示，采用 t 檢驗(yàn)，兩兩比較組間差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

含有 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μM 6 種不同濃度鴉膽子素 D 的培養(yǎng)液培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞 24 h 與48 h，不同作用濃度及作用時(shí)間下 143B HOS 細(xì)胞增值率結(jié)果如表 1 所示。相同作用時(shí)間內(nèi)隨著鴉膽子素 D 物質(zhì)的量濃度的升高，細(xì)胞的增殖率下降，與對(duì)照組 ( 0 μM ) 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 1a )。此外，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的克隆形成數(shù)逐漸減少 ( 圖 1b )。

二、鴉膽子素 D 引起骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯

用含 0、1.0、2.0、4.0 μM 鴉膽子素 D 的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其各周期相占比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 2 所示?？梢?，隨著作用濃度的升高，處于 G0 / G1 期的細(xì)胞比例逐漸升高，處于G2 / M 期的細(xì)胞比例逐漸下降，與對(duì)照組 ( 0 μM ) 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 2 )。

三、鴉膽子素 D 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

用含 0、1.0、2.0、4.0 μM 鴉膽子素 D 的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 3 所示。隨著鴉膽子素 D 質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率增加 ( 圖 3 )。不同物質(zhì)的量濃度鴉膽子素 D 處理的細(xì)胞與對(duì)照組 ( 0 μM ) 相比在凋亡率上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

此外，采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 培養(yǎng)液處理下細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved PARP 的表達(dá)水平。加有鴉膽子素 D 組細(xì)胞中 Cleaved PARP 蛋白的表達(dá)水平高于未加藥組，且隨著藥物濃度的升高，Cleaved PARP蛋白的表達(dá)也隨之上升 ( 圖 4 )。

表 1 鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 ( x- ± s，% )Tab.1 Effects of Bruceine D on the proliferation of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

表 2 鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期的影響 ( x- ± s，% )Tab.2 Effects of Bruceine D on the cell cycle of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

圖 1 鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖 a～b：CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鴉膽子素 D 對(duì) 143B HOS 細(xì)胞增殖的影響；c～d：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鴉膽子素 D 對(duì) 143B HOS 細(xì)胞克隆形成的影響 ( 與對(duì)照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )Fig.1 Bruceine D inhibited the proliferation of osteos arcoma cells a - b: The anti-proliferative effects of Bruceine D on 143B HOS cells were detected by CCK8 assay; c - d: The results of colony formation assay showed the effects of Bruceine D on the colony formation of colonies of 143B HOS cells (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group )

圖 2 鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞 G0 / G1 期阻滯a：鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯結(jié)果；b：直方圖 ( 與對(duì)照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )Fig.2 Bruceine D induced G0 / G1 phase arrest in osteosarcoma cells a: The results of cell cycle arrest assay; b: Histogram (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group )

圖 3 鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡 a：鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果；b：直方圖 ( 與對(duì)照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )；c：Western Blot 檢測(cè)不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS 細(xì)胞 Cleaved PARP 的表達(dá)情況Fig.3 Evidence that Bruceine D induced apoptosis in osteosarcoma cells a: The apoptosis proportion of 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D was analyzed by fl ow cytometry; b: Histogram (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group ); c: The expression of Cleaved PARP in 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D was detected by western blot assay

表 3 鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 ( x- ± s，% )Tab.3 Effects of Bruceine D on the apoptosis of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

四、鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生自噬

用 0、1.0、2.0、4.0 μM 4 種不同濃度鴉膽子素 D 培養(yǎng)液處理 143B HOS 細(xì)胞 24 h，采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同藥物濃度下細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B 的表達(dá)情況 ( 圖 4b )，隨著藥物濃度的增加，LC3B-I 蛋白的表達(dá)量逐漸減少，LC3B-II 蛋白的表達(dá)量逐漸增加。之后，采用 LC3 熒光鼬合蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)自噬體的存在。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)鴉膽子素 D 培養(yǎng)液處理的 143B 細(xì)胞的綠色熒光斑點(diǎn)明顯增多 ( 圖 4a )。

討 論

CCK8 實(shí)驗(yàn)可以用于檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸下降，說(shuō)明鴉膽子素 D 具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用。平板克隆實(shí)驗(yàn)可用于研究藥物對(duì)細(xì)胞的毒性以及細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[8]，也可以反映細(xì)胞增殖特點(diǎn)以及群體依賴性，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞克隆數(shù)也隨之減少，這也進(jìn)一步證實(shí)了鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

細(xì)胞分裂的周期大致分為四個(gè)時(shí)相：G1 期、S 期、G2 期以及 M 期。一些細(xì)胞周期特異性藥物只對(duì)增殖周期的某一時(shí)相敏感，可通過(guò)將細(xì)胞阻滯于某一周期進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。為了探究鴉膽子素 D 是否具有這一特征，筆者進(jìn)行了細(xì)胞周期檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 作用下，處于 G0 / G1期的 143B HOS 細(xì)胞比例隨著藥物濃度的增加而增加，各濃度與對(duì)照組 ( 0 μM ) 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。這表明鴉膽子素 D 具有阻滯 G0 / G1期細(xì)胞，延長(zhǎng)細(xì)胞增殖周期作用。而這也一定程度上解釋了鴉膽子素 D 為什么會(huì)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

目前認(rèn)為細(xì)胞程序性死亡主要有三種方式：凋亡[9]、壞死及細(xì)胞自噬導(dǎo)致的自噬性細(xì)胞死亡[10]。為了探究誘發(fā)細(xì)胞凋亡是否為鴉膽子素 D 抑制細(xì)胞增殖的原因，筆者使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組 ( 0 μM ) 細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例很少，隨著藥物濃度增加，凋亡細(xì)胞比例明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。為了進(jìn)一步確證鴉膽子素 D 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用，筆者又檢測(cè)了藥物作用下143B HOS 細(xì)胞中 Cleaved PARP 的蛋白表達(dá)情況。PARP ( 聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ) 可識(shí)別結(jié)構(gòu)損傷的 DNA 片段，有助于修復(fù)蛋白與 DNA 結(jié)合并進(jìn)行修復(fù)[11]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其被 caspase-3 裂解形成 Cleaved PARP 從而失去活性[12]，故可作為細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志蛋白之一。在蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)中，對(duì)照組的 Cleaved PARP 蛋白幾乎不表達(dá)，而隨著藥物濃度的增加，c-PARP 的表達(dá)也逐漸增高這進(jìn)一步說(shuō)明了鴉膽子素 D 可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

圖 4 鴉膽子素 D 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬 a：不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B 細(xì)胞內(nèi) GFP-LC3 熒光斑點(diǎn)的熒光顯微鏡分析，比例尺為50 μM；b：Western Blot 檢測(cè)不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS 細(xì)胞 LC3B-I 與 LC3B-II 的表達(dá)情況Fig.4 Evidence that Bruceine D induced autophagy in osteosarcoma cells a: The punctate patterns of GFP-LC3 expression in 143B cells treated with various concentrations of Bruceine D were examined using fl uorescent microscope. Scale bars = 50 μM; b: The expressions of LC3B-I and LC3B-II in 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D were detected by western blot assay

為進(jìn)一步探究鴉膽子素 D 是否可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的自噬，筆者對(duì)不同藥物濃度處理后的143B HOS 細(xì)胞 LC3B 蛋白的表達(dá)進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。LC3B 為 LC3 蛋白的一種，LC-3 為目前檢測(cè)最為廣泛的自噬相關(guān)蛋白之一，從 LC3B-I 到LC3B-II 的轉(zhuǎn)變以及 LC3B-II 的積聚可以從一定程度上反應(yīng)細(xì)胞自噬的發(fā)生[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，LC3B-II 的表達(dá)也隨之升高。LC3 熒光鼬合蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)也是常見的檢測(cè)細(xì)胞自噬的方法之一，與對(duì)照組 ( 0 μM ) 相比，經(jīng) 2 μM 鴉膽子素D 處理后的 143B 細(xì)胞的綠色熒光斑點(diǎn)顯著增多，提示鴉膽子素 D 使得 143B 細(xì)胞的自噬體生成增多，這說(shuō)明鴉膽子素 D 可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生。

綜上所述，鴉膽子素 D 具有抑制骨肉瘤 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬作用。這意味著鴉膽子素 D 在骨肉瘤治療方面可能存在著潛在的價(jià)值，但對(duì)骨肉瘤細(xì)胞作用的具體機(jī)制并不明了，還需更多后續(xù)研究。

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( 本文編輯：裴艷宏 )

Effects of Bruceine D on the proliferation, apoptosis and autophagy of osteosarcoma cells

ZHENG Ying, WANG Gang-yang, CHEN Rui-ling, HUA Ying-qi, CAI Zheng-dong. Department of Orthopedics, the fi rst People’s Hospital Aff i liated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Bone Tumor Instituticn, Shanghai, 200080, China

CAI Zheng-dong, Email: czd856@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the definite effects of Bruceine D on inhibiting the proliferation of osteosarcoma cells and inducing the apoptosis and autophagy in osteosarcoma cells.MethodsThe anti-proliferative effects of Bruceine D on 143B HOS cells were detected by CCK8 assay. Colony formation assay was used to detect the colony formation of 143B HOS cells treated with Bruceine D. The Bruceine D’s effects of cell cycle arresting on 143B HOS cells were analyzed by fl ow cytometry. The Bruceine D’s effects of inducing apoptosis in 143B HOS cells were investigated by fl ow cytometry and Western blot assay. We measured the autophagy associated proteins expressed in 143B HOS cells treated with Bruceine D by fl uorescence microscope. The Bruceine D’s effects of inducing autophagy were also investigated by GFP-LC3 punctate assay.Results( 1 ) The CCK8 assay showed that the cell viability and number of colonies of 143B HOS treated with Bruceine D were decreased. ( 2 ) A higher ratio of G0 to G1 phase cells in 143B HOS was caused by Bruceine D, which was found by using fl ow cytometry. ( 3 ) The apoptosis proportion of 143B HOS treated with Bruceine D was increased, which was found by using fl ow cytometry; The western blot assay showed the expression level of Cleaved PARP was increased in 143B HOS. ( 4 ) The western blot assay showed the expression level of LC3B-II was increased in 143B HOS; The 143B cells treated by Bruceine D displayed a punctate pattern of GFP-LC3 expression, which was found by using fl uorescence microscope.Conclusions( 1 ) Bruceine D inhibits the proliferation of osteosarcoma cells. ( 2 ) Bruceine D induces the apoptosis of osteosarcoma cells. ( 3 ) Bruceine D induces the autophagy of osteosarcoma cells.

Osteosarcoma; Bruceine; Cell proliferation; Apoptosis; Autophagy

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.06.007

R738.1, R915

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 ( 81202115 )

作者單位：200080 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海市骨腫瘤研究所

蔡鄭東，Email: czd856@vip.163.com

2017-01-20 )