杜 暘，金 鼎，高秀秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州121000)

人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLFs)的增殖分化是牙周組織再生重建的關(guān)鍵。但是在牙周病損區(qū)域HPDLFs細(xì)胞相對(duì)較少。將體外構(gòu)建的HPDLFs-細(xì)胞支架復(fù)合體移植入牙周缺損區(qū)是一種重要牙周病治療方法［1，2］，但尚無滿意細(xì)胞支架可用。2011年10月～12月，我們將丹參復(fù)合在絲素/膠原支架上，得到復(fù)合丹參的絲素/膠原支架，并用其體外培養(yǎng)HPDLFs，效果滿意?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選臨床上12歲左右因正畸拔除的健康前磨牙，家蠶的桑蠶繭。主要試劑:膠原(上海生工生物試劑公司，主要成分為Ⅰ型膠原)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品)，DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO，美國)，胰蛋白酶(Amresco)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，美國)，抗廣譜角蛋白抗體(武漢博士德公司)，抗波形蛋白抗體(Vimentin)，丹參提取物(美晨藥業(yè)有限公司)。儀器設(shè)備:倒置顯微鏡(日本Olympus)，S-3000N型掃描電鏡(Hitachi，日本)，HPll00高效液相色譜儀，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，冷凍干燥機(jī)(VIRTIS GENESIS 25 LE型)，超凈工作臺(tái)(國產(chǎn)TDGC-2J-1型)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合丹參的絲素/膠原細(xì)胞支架的制備 蠶絲置于98～100℃的含0.1%的Na2CO3溶液中處理30 min，重復(fù)3次，晾干后溶解于摩爾比為1∶2∶8的CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶劑中，在(70± 2)℃攪拌溶解，依次進(jìn)行透析、過濾、濃縮后獲得絲素水溶液。按膠原絲素水溶液質(zhì)量比80∶20混合，添加一定量的戊二醛，充分?jǐn)嚢瑁美鋬龈稍餀C(jī)，分別依次于－80℃、－40℃及－20℃冷凍6 h，隨后減壓干燥，得到膠原/絲素支架。在75%乙醇中滅菌處理后，紫外線照射，晾干。每個(gè)支架均勻滴入大約含有20 ng的丹參，再次凍干備用。

1.2.2 復(fù)合支架上丹參釋放情況的檢測(cè) 取8塊復(fù)合丹參的支架、2塊直接滴入20 ng丹參的空白支架，分別為觀察組和對(duì)照組。將其置入轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/min、溫度為37℃的轉(zhuǎn)籃進(jìn)入釋放池計(jì)時(shí)。分別在30 min、1 h、2 h、4 h、24 h、1周、2周、4周吸出培養(yǎng)液作為檢測(cè)樣本，以高效液相色譜法檢測(cè)丹參的有效成分含量，計(jì)算各時(shí)點(diǎn)丹參釋放量占總釋放量的百分比。

1.2.3 HPDLFs的原代培養(yǎng)及鑒定 取正畸拔除的上頜第1前磨牙，用PBS液反復(fù)沖洗，無菌條件刮取牙取根中1/3的牙周組織，均勻剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，均勻布在培養(yǎng)瓶底，將此培養(yǎng)瓶倒置放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、5%CO2、100%濕度)，4 h后翻轉(zhuǎn)，以4 mL含胎牛血清青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)靜置孵育，每3 d更換培養(yǎng)液1次，倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞達(dá)到匯合點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行消化傳代。原代培養(yǎng)傳至第4代用于實(shí)驗(yàn)。以SABC法檢測(cè)角蛋白、波形蛋白抗體鑒定細(xì)胞來源。

1.2.4 HPDLFs接種及分組 將傳代培養(yǎng)第4代HPDLFs用0.25%胰酶消化后稀釋至1×106/mL，接種于復(fù)合丹參的絲素/膠原細(xì)胞支架上。置于37℃、5%CO2孵箱中。靜置4 h后，以2.0 mL含胎牛血清青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，CO2孵箱中靜置孵育，每隔3 d換液1次。

1.2.5 HPDLFs增殖情況及支架結(jié)構(gòu)的觀察 取7 d時(shí)細(xì)胞材料復(fù)合物，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，再經(jīng)過乙醇梯度系列脫水，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.6 HPDLFs增殖的檢測(cè)方法 采用MTT法。取上述方法制取的含丹參與不含丹參的支架各24塊，分別置于24孔培養(yǎng)板中，為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。取生長狀態(tài)良好的貼壁HPDLFs用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，按上述方法接種于支架材料，分別于第1、7、14和28天取出樣本各5塊，每mL分別加入5 mg不含血清的DMEM 900 μL及MTT 100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，振蕩30 min直至結(jié)晶物充分溶解，于490 nm的波長下測(cè)光密度值，每孔測(cè)3次，取平均值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組支架上丹參釋放情況 觀察組的丹參在4 h內(nèi)就釋放了將近50%，24 h內(nèi)釋放掉總量的近60%，1周釋放掉總量的近75%，2周時(shí)達(dá)85%，4周基本釋放完全。對(duì)照組在24 h時(shí)基本釋放完全。見表1。

2.2 HPDLFs增殖情況及支架結(jié)構(gòu) 掃描電鏡觀察可見絲素/膠原支架有良好的多孔狀結(jié)構(gòu)。HPDLCs在支架上，伸展充分，貼附牢固。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)丹參釋放率比較(±s)

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)丹參釋放率比較(±s)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05

0.5 h 2 h 4 h 24 h 72 h 168 h 336 h 672 h對(duì)照組 52.1±0.3 78.1±0.5 88.9±0.4 90.6±0.3 94.3±0.組別 丹參釋放率(%) 3 95.4±0.2 96.4±0.5 99.2±0.6觀察組 20.0±0.5* 30.6±0.4* 49.5±0.3* 62.5±0.5* 70.3±0.3* 75.5±0.2* 85.0±0.2* 95.3±0.3*

2.3 HPDLFs增殖情況 接種后第1、7、14和28天兩組光密度值見表2。

表2 兩組接種后各時(shí)點(diǎn)光密度值比較(±s)

表2 兩組接種后各時(shí)點(diǎn)光密度值比較(±s)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別 光密度值1 d 7 d 14 d 28 d實(shí)驗(yàn)組 0.8±0.4 1.6±0.4* 2.2±0.4* 2.4±0.4*對(duì)照組0.7±0.1 1.1±0.1 1.5±0.1 1.7±0.2

3 討論

丹參是我國傳統(tǒng)中藥，能夠促進(jìn)牙周組織的再生。有學(xué)者觀察到用丹參復(fù)合的生物膜在誘導(dǎo)牙骨質(zhì)和牙槽骨的再生方面能有很大的作用［3］。研究表明，丹參具有改善局部組織的微循環(huán)的作用，能夠增加血液的供應(yīng);丹參能夠提升局部組織促細(xì)胞免疫，保證了局部微環(huán)境中各種細(xì)胞生長因子的產(chǎn)生，從而起到了影響組織再生和修復(fù)細(xì)胞再生的作用［4～6］。其機(jī)制可能是加速了鄰近骨組織中鋅的動(dòng)員以及提高血清鋅含量，并通過提高支架內(nèi)骨化物中鋅含量、鋅/銅比值來加速組織生長和鈣化過程［7］。

絲素膠原復(fù)合膜是一種載藥膜緩釋系統(tǒng)，具有良好的生物相容性［8，9］，且膠原有低免疫原性，是一種天然的具有兩性荷電性能的聚氨基酸膜。其本身具有特殊的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因而具有優(yōu)良的吸附及緩釋功能［10］。本實(shí)驗(yàn)制取的復(fù)合膜其孔隙率在75%以上［11］有著良好的空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了HPDLCs的生長、黏附及增殖且無細(xì)胞毒性。

本研究以凍干法復(fù)合絲素/膠原作為丹參的控釋材料，在4周時(shí)仍能檢測(cè)到丹參的少量釋放，而在無控釋材料的情況下，丹參24 h內(nèi)即降解完畢，說明控釋材料較大程度地延長了丹參的作用時(shí)間，一定程度上控制了有效因子的釋放。經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在第21天內(nèi)丹參仍能釋放出有效濃度，從而促進(jìn)HPDLFs的增殖。當(dāng)然，復(fù)合材料對(duì)丹參的控釋過程并不完善，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)早期過多過快，釋放的量不能與時(shí)間配合以滿足臨床治療。因此，如何改進(jìn)材料的控釋效應(yīng)做進(jìn)一步研究。

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［4］周金寶，肇毅，朱海青，等.丹參藥膜對(duì)胃壁創(chuàng)傷組織PDGF表達(dá)的影響［J］.山東中醫(yī)雜志，2005，24(2):105-106.

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