樓 琦，石巧娟，2，郭紅剛，李 巍，盧領(lǐng)群，周文偉，薩曉嬰

（1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 杭州 310031）

非酒精性脂肪肝 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無(wú)過(guò)量飲酒史（酒精攝入量＜20 g/d），而以肝細(xì)胞脂質(zhì)貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥。根據(jù)其疾病發(fā)展的不同階段主要分為：?jiǎn)渭冎靖?、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過(guò)程［1，2］。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，日常膳食脂肪為代表的高熱量食物成分所占比例明顯增加，使與代謝異常密切相關(guān)的NAFLD的發(fā)病率大幅上升，并已成為醫(yī)學(xué)關(guān)注和研究的焦點(diǎn)［3，4］。目前 NAFLD的發(fā)病機(jī)制仍尚未闡明，多種因素與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前認(rèn)為主要有炎癥、氧自由基、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、鐵超載等作用因素［5-9］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，連續(xù)監(jiān)測(cè)模型動(dòng)物4～16周肝功能指標(biāo)、血脂、血糖及胰島素水平，同時(shí)通過(guò)TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡水平，并對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察，探討肝功能、脂質(zhì)代謝、糖代謝及肝細(xì)胞凋亡在NAFLD進(jìn)展過(guò)程中的變化情況、及相互作用關(guān)系，也為該模型在脂肪肝發(fā)病機(jī)制、脂肪肝治療藥物評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠50只購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK（浙）2008-0033；使用許可證號(hào)：SYXK（浙） 2008-0033）。大鼠普通飼料及高脂飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工生產(chǎn)，高脂飼料在相關(guān)配制方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn) ，配方為：普通飼料80.5％、蛋黃粉10％ 、豬油7％ 、膽固醇2％，三號(hào)膽鹽0.5％［10-13］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：蛋黃粉為浙江省長(zhǎng)興縣艾格生物制品有限公司產(chǎn)品。膽固醇，三號(hào)膽鹽購(gòu)于華東醫(yī)藥股份有限公司。食用豬油購(gòu)于超市。谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT），血糖（GLU），膽固醇（CHO），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白（LDL）診斷試劑盒購(gòu)自上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司；胰島素放免試劑盒（IMK414）購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院，由杭州市第二人民醫(yī)院完成盲樣檢測(cè)。TUNNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒為BIO-HIGH TECH公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：意大利AUTOLAB全自動(dòng)生化分析儀、日本 OLYMPUS生物顯微鏡，美國(guó) Media Cybernetics公司多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)，德國(guó)萊卡切片機(jī)，低溫高速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立

清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d以后，隨機(jī)分為5組，①正常對(duì)照組，②4周模型組③8周模型組④12周模型組⑤16周模型組，每組10只，①組給予基礎(chǔ)飼料，其余4組飼喂高脂飼料，自由進(jìn)水進(jìn)食，觀察動(dòng)物一般情況，每周稱(chēng)體重。每隔4周依次處理②～④組，16周后將①組和⑤組動(dòng)物一并處理。動(dòng)物處理前禁食12 h，以乙醚麻醉大鼠，稱(chēng)重，腹主動(dòng)脈采血，分離血清；迅速取出肝臟并稱(chēng)重，計(jì)算肝臟指數(shù)（肝臟濕重/體重）；取最大葉肝臟用10％中性甲醛固定，作肝組織病理學(xué)觀察，其余肝臟-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

GLU測(cè)定采用氧化酶法；CHO測(cè)定采用CHOD-PAP法；TG測(cè)定采用 GPO-PAP法；HDL、LDL測(cè)定采用直接法；GPT、GOT測(cè)定采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法；胰島素測(cè)定采用放射免疫法；具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖含量×空腹胰島素含量/22.5。

1.2.3 病理學(xué)檢查

肝組織用福爾馬林固定、石蠟切片、HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化。所有切片通過(guò)盲法閱片作出診斷，每張切片觀察5個(gè)×200視野，對(duì)肝脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度分級(jí)，評(píng)分。肝脂肪變性根據(jù)脂滴細(xì)胞所占面積/總細(xì)胞所占面積之比值分為0，＜1/3，1/3～2/3和 ＞2/3 4個(gè)等級(jí)，達(dá)到2級(jí)或以上診斷為脂肪肝。炎癥活動(dòng)度計(jì)分：分為匯管區(qū)炎癥（P）、小葉內(nèi)炎癥（L）、碎屑樣壞死（PN）和橋接壞死（BN）4項(xiàng)，每項(xiàng)根據(jù)病變程度分別計(jì)1，2，3，4分，因?yàn)樗樾紭訅乃篮蜆蚪訅乃绹?yán)重度與預(yù)后直接相關(guān)，計(jì)分公式為P+L+2PN+2BN。

1.2.4 TUNNEL法測(cè)定肝細(xì)胞凋亡

肝臟組織以中性甲醛固定，多聚賴(lài)氨酸為切片粘合劑，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，按TUNNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。滴加蛋白酶 K （20μg/m L溶于PBS中），室溫孵育30 m in，PBS沖洗2遍，滴加50μL TUNNEL反應(yīng)混合物，在濕盒中37℃孵育 60 m in，PBS沖洗，加入 50μL轉(zhuǎn)化劑POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗2遍，加入50μL DAB底物溶液，室溫孵育10 m in。封片，在光鏡下分析結(jié)果，根據(jù)凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征判斷凋亡細(xì)胞：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞，周?chē)鸁o(wú)炎癥反應(yīng)及壞死，胞漿收縮，細(xì)胞核中有棕黃色顆?；蚝怂槠邽殛?yáng)性細(xì)胞。每張切片觀察10個(gè)高倍鏡（10×40）視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者采用單因素方差分析，方差不齊者采用H檢驗(yàn)，比較模型組與對(duì)照組及模型組間在血清學(xué)、病理學(xué)及細(xì)胞凋亡程度上的差別；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用多元線(xiàn)性回歸分析，評(píng)估肝組織病理學(xué)改變與肝功能，脂質(zhì)代謝，糖代謝及肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間正常對(duì)照組大鼠活動(dòng)度好，飲食正常，皮毛整潔；高脂模型組大鼠嗜睡，毛色偏黃，10周后動(dòng)物有不同程度的精神萎靡，活動(dòng)減少，皮毛凌亂的情況。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠體重持續(xù)上升，各組間無(wú)顯著性差異（見(jiàn)圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠全部存活。

圖1 各組大鼠體重變化Fig.1 Changes of body weight of animals in groups

2.2 血清生化指標(biāo)的分析

各組大鼠血脂代謝TG、CHO、HDL-C、LDL-C含量的變化見(jiàn)表1。第4周起模型大鼠血清 CHO、LDL-C與正常對(duì)照組比較明顯升高，有顯著性差異，并隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步上升。TG、HDL-L在造模4～8周期間，呈明顯下降趨勢(shì)，12周后又有所反彈，與正常對(duì)照組基本持平，16周則有進(jìn)一步升高的趨勢(shì)?？傮w數(shù)據(jù)體現(xiàn)了模型組大鼠具有脂質(zhì)代謝紊亂的特征。

表1 各組血清CHO、TG、HDL-C、LDL-C水平比較Tab.1 The comparison of serum CHO，TG，HDL-C，LDL-C level in the rats of all the groups

各組大鼠肝功能指標(biāo)GOT，GPT及臟器系數(shù)的變化見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，各模型組 GOT，GPT，臟器系數(shù)顯著升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各個(gè)值與隨著造模時(shí)間呈良好的時(shí)效關(guān)系。說(shuō)明模型組大鼠4周后就出現(xiàn)肝功能損傷及腫脹，且造模時(shí)間越長(zhǎng)，損傷、腫脹程度越嚴(yán)重。

各組大鼠GLU，胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)見(jiàn)表3，各組間GLU水平未見(jiàn)明顯差異。與正常對(duì)照組比較，高脂模型組胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明模型組大鼠在造模4周后即發(fā)生明顯的胰島素抵抗，但對(duì)糖代謝無(wú)明顯影響。

2.3 肝組織形態(tài)學(xué)及病理觀察

2.3.1 肉眼觀察 正常對(duì)照組大鼠肝臟形態(tài)正常。高脂模型組大鼠第4周起肝臟外形稍飽滿(mǎn)圓鈍，色紅，質(zhì)地較脆；8～16周，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟體積增大，色澤土黃，包膜緊張，切面油膩，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，肝臟明顯增大，包膜緊張，邊緣較鈍，質(zhì)地略軟，色變黃，表面呈花斑狀，觸之似泥塊并有油膩感，部分大鼠肝臟有黃白色的局灶性脂肪沉積。

2.3.2 光鏡觀察 ①正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰，胞核圓，位于細(xì)胞中央，偶見(jiàn)雙核，胞質(zhì)豐富，肝竇中枯否細(xì)胞清晰可見(jiàn)，匯管區(qū)偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。（見(jiàn)彩插1圖2①）

4周模型組 肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整清晰，肝索放射狀排列明顯，部分肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)大小不等的脂肪空泡，脂肪空泡將細(xì)胞核擠向一側(cè)，尤其以肝小葉交匯處脂變更為明顯，肝細(xì)胞以氣球樣變?yōu)橹?，在中央靜脈及匯管區(qū)周邊脂變程度較輕。肝竇變窄，僅有枯否細(xì)胞處可見(jiàn)明顯肝竇。匯管區(qū)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)肝細(xì)胞壞死灶。（見(jiàn)彩插1圖2②）

8周模型組 肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索放射狀排列不明顯，大部分細(xì)胞腫脹，并大小不均，細(xì)胞輪廓模糊，胞核消失或被脂肪空泡擠向一側(cè)。肝細(xì)胞以氣球樣變?yōu)橹?，匯管區(qū)及小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和散在的點(diǎn)狀壞死增多。（見(jiàn)彩插1圖2③）

12周模型組 肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，呈中～重度脂肪變，均可見(jiàn)到小葉內(nèi)炎癥，炎癥細(xì)胞主要以單個(gè)核細(xì)胞為主，炎癥程度明顯加重，點(diǎn)狀或小灶性，部分大鼠可見(jiàn)數(shù)個(gè)炎癥壞死灶融合成片，匯管區(qū)亦可見(jiàn)到以淋巴細(xì)胞為主炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但程度較小葉內(nèi)輕。（見(jiàn)彩插1圖2④）

16周模型組 肝細(xì)胞脂變進(jìn)一步嚴(yán)重，常見(jiàn)炎癥壞死灶融合成片，但未見(jiàn)明顯的肝纖維化發(fā)生。（見(jiàn)彩插1圖2⑤）。

與正常對(duì)照組比較，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物肝細(xì)胞脂肪變性及組織炎癥進(jìn)一步加重。（見(jiàn)表4）。

2.4 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)

表2 各組血清GOT、GPT水平及肝臟系數(shù)比較Tab.2 The comparison of serum GOT，GPT level and organ indexes in the rats of all the groups

表3 各組血清GLU，胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)比較Tab.3 The comparison of serum GLU，insulin level and insulin resistance indexes in the rats of all the groups

經(jīng)TUNNEL染色，陽(yáng)性物質(zhì)成棕黃色，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，常聚集于核膜附近或核質(zhì)呈現(xiàn)均勻的染色（見(jiàn)表4，彩插1圖3①～⑤）。正常對(duì)照組大鼠肝組織TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)，在中央靜脈周?chē)膳家?jiàn)有染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。模型組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)及肝細(xì)胞脂變、炎癥、壞死的加重，TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。模型組發(fā)生凋亡的肝細(xì)胞常位于脂肪變嚴(yán)重以及炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)區(qū)域附近。

2.5 相關(guān)性分析

分析實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能、脂質(zhì)代謝、糖代謝及肝細(xì)胞凋亡對(duì)肝組織病理改變的影響。行多元線(xiàn)性相關(guān)分析表明（見(jiàn)表5），GOT，GPT，肝重，肝臟系數(shù)，TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與肝組織炎癥成呈正相關(guān)（P＜0.01），GOT，GPT，CHO，LDL，胰島素，胰島素抵抗指數(shù)，肝重，肝臟系數(shù)，TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與肝脂肪變性程度成正相關(guān)（P ＜0.01或 P ＜0.05），而與 TG，HDL等無(wú)相關(guān)性，以上結(jié)果說(shuō)明肝功能損傷，脂質(zhì)代謝紊亂及肝細(xì)胞凋亡是引起非酒精性脂肪肝中脂肪變性和炎癥的重要因素。

3 討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）又名程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），為生物體內(nèi)廣泛存在的特定基因控制，以細(xì)胞DNA降解為特征，無(wú)明顯細(xì)胞溶解的細(xì)胞自殺過(guò)程。細(xì)胞凋亡具有重要的生物學(xué)意義，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡可以清除衰老、受損或有害的細(xì)胞，從而保持細(xì)胞微環(huán)境的正常［14］。細(xì)胞凋亡的機(jī)制一旦失調(diào)將會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。對(duì)肝臟而言，生理狀況下的細(xì)胞凋亡可以消除衰老的細(xì)胞，清除受損傷或有癌前病變的細(xì)胞從而調(diào)節(jié)正常肝細(xì)胞數(shù)量，維持肝臟正常體積；但在病理?xiàng)l件下的肝細(xì)胞凋亡參與嚴(yán)重疾病的發(fā)生發(fā)展，肝癌、酒精性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝病的發(fā)病機(jī)制均已證明與肝細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［15］。近些年來(lái)有研究認(rèn)為在 NAFLD進(jìn)展過(guò)程中隨著肝細(xì)胞炎癥、壞死的增多，細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯增加。Feldstein等［16，17］對(duì)非酒精性脂肪肝患者肝活組織標(biāo)本應(yīng)用TUNNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡明顯增加，并且細(xì)胞凋亡隨肝纖維化和脂肪性肝炎炎癥病變程度增加而增加。本實(shí)驗(yàn)研究表明正常對(duì)照組大鼠肝組織TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)，在中央靜脈周?chē)膳家?jiàn)有染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。模型組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)及肝細(xì)胞脂變、炎癥、壞死的加重，TUNNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，表明連續(xù)的肝細(xì)胞凋亡可能調(diào)節(jié)炎癥，甚至是肝纖維化進(jìn)程，該結(jié)果與國(guó)外研究一致［18，19］，其機(jī)制可能為在脂肪肝發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝組織中細(xì)胞色素氧化酶 P450 2E1表達(dá)增強(qiáng)，氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷加重，以及枯否細(xì)胞激活等途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生，由此也說(shuō)明了NAFLD肝細(xì)胞凋亡在由單純性脂肪肝轉(zhuǎn)變?yōu)楦渭?xì)胞炎癥、壞死甚至是肝纖維化過(guò)程中起重要作用。

表4 各組肝組織病理變化及細(xì)胞凋亡程度比較Tab.4 The comparison of liver pathology and apoptosis in the rats of all the groups

表5 肝功能、脂質(zhì)代謝、糖代謝及肝細(xì)胞凋亡對(duì)肝組織病理改變相關(guān)性分析（R值）Tab.5 The correlation analysis of liver pathology between liver function，lipid metabolism，carbohydrate metabolism and hepatocyte apoptosis（R value）

已有研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝與代謝綜合征密切相關(guān)，胰島素抵抗可能在脂肪肝形成過(guò)程中起了重要的作用，甚至有人提出將脂肪肝作為代謝綜合征的組成成分之一［20］。Marchesini等用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法判斷胰島素抵抗 （HOMA-IR），研究了脂肪肝與胰島素抵抗之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪肝病人存在空腹和餐后高胰島素血癥，餐后高甘油三酯血癥及明顯的胰島素抵抗，而且在瘦的脂肪肝病人得到了相同的結(jié)果。Marchesini［21，22］用高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在胰島素輸注率 40 mU/（m2·min）時(shí)，脂肪肝病人與正常對(duì)照組葡萄糖輸注率分別為19.5±5.7μmol/（kg·min）和37.2±9.4μmol/（kg ·min），兩組的肝糖合成較基線(xiàn)水平分別下降 63％ ±9％和82％±14％，證實(shí)了脂肪肝病人均存在胰島素抵抗。

DAY通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究提出，IR可能作為原發(fā)因素參與了脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，并以“二次打擊”學(xué)說(shuō)對(duì)非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行闡述［23］。其初次打擊主要是胰島素抵抗，通過(guò)促使外周脂肪分解增加和胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪堆積，并誘導(dǎo)其對(duì)損害因子的敏感性增高。在此階段，由于機(jī)體組織適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制的抗氧化、抗細(xì)胞調(diào)亡、瘦素的抗脂肪毒性等防御功能可與上述因素相抗衡，故大多數(shù)單純脂肪肝的結(jié)構(gòu)和功能改變是可逆的［24，25］。

二次打擊主要是氧應(yīng)激，最后導(dǎo)致炎癥和纖維化。在脂肪的演變中，發(fā)生腫瘤壞死因子-瘦素-胰島素反饋軸改變，胰島素抵抗進(jìn)一步削弱了抗葡萄糖變性和抗脂肪變性的能力，適應(yīng)性反應(yīng)出現(xiàn)缺陷，細(xì)胞防御機(jī)制減弱，另外，缺氧、內(nèi)毒素、藥物等作為附加因素實(shí)行多重打擊［26-28］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明：SD大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)4周即可引起胰島素水平的增加，發(fā)生胰島素抵抗，并在4～16周的造模期間，胰島素抵抗持續(xù)存在，由于造模時(shí)間的延長(zhǎng)，病理變化逐步加強(qiáng)，因此，在脂肪肝的發(fā)展中，胰島素抵抗造成的肝細(xì)胞代謝異常，作為第一次打擊的基礎(chǔ)，起到了重要的作用。在脂肪肝治療的方法中如減少胰島素抵抗，減少反應(yīng)性氧化體系的生成增多，減少肝脂質(zhì)過(guò)氧化等因素，就有可能阻礙脂肪肝的形成。

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