李燕飛，黃 磊，王 普，徐志南

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310032;2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系生物工程研究所，浙江杭州310027)

番茄紅素是一種重要的天然植物色素，分子式為C40H56，是由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵組成的多不飽和脂溶性烴類(lèi)化合物，在自然界中主要存在于西瓜、番茄等蔬菜水果中［1］。番茄紅素具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能夠通過(guò)接受電子激發(fā)態(tài)的能量，使單線態(tài)氧的能量轉(zhuǎn)移到番茄紅素中，從而淬滅單線態(tài)氧和清除自由基，防止DNA受到氧化破壞，減輕細(xì)胞損傷和預(yù)防癌癥的發(fā)生。此外，通過(guò)降低血清脂質(zhì)過(guò)氧化和低密度脂蛋白的氧化，番茄紅素還能減輕脂肪肝病變程度，防止或延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成［2，3］，近年來(lái)其相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)已成為國(guó)際上新藥研究的熱點(diǎn)。到目前為止，番茄紅素生產(chǎn)方法主要有天然提取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法三種。天然提取法主要是以西紅柿為原料通過(guò)萃取的方法獲得番茄紅素，但由于原料含量太低導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下，且生產(chǎn)受季節(jié)影響明顯，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。化學(xué)合成法雖然成本較低，但由于雙鍵立體選擇性難以控制致使產(chǎn)物不可控，且使用的化學(xué)試劑在產(chǎn)品中會(huì)有不同程度的殘留。相比之下，微生物發(fā)酵法具有工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)氣候影響、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為番茄紅素最為理想的生產(chǎn)方法。迄今為止，能夠用于生產(chǎn)番茄紅素的微生物主要有紅色細(xì)菌、三孢布拉氏霉菌、小球藻以及基因工程菌，特別是隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，利用重組大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素已成為研究的熱點(diǎn)。

1 番茄紅素的生物合成途徑

1.1 番茄紅素在植物、真菌和細(xì)菌中的生物合成途徑 番茄紅素是類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，研究表明所有的類(lèi)胡蘿卜素都是由類(lèi)異戊二烯化合物或萜類(lèi)化合物合成的。在植物細(xì)胞液和真菌中，番茄紅素通過(guò)甲羥戊酸途徑(MVA途徑)合成:最初3個(gè)乙酰輔酶A分子通過(guò)失去1個(gè)分子的羧基縮合成3－甲基－3，5－二甲基戊酸(MVA)，MVA通過(guò)兩步激酶反應(yīng)生成甲羥戊酸－5－磷酸(MVAP)和甲羥戊酸－5－焦磷酸(MVAPP)，MVAPP最后通過(guò)脫羧反應(yīng)生成異戊烯焦磷酸(IPP)，IPP在IPP異構(gòu)酶作用下異構(gòu)化形成3，3－二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)，DMAPP再與3個(gè)分子的 IPP作用縮合依次生成牻牛兒焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(GGPP)，兩個(gè)分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶(PSY)作用下聚合產(chǎn)生第一個(gè)無(wú)色類(lèi)胡蘿卜素—八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經(jīng)過(guò)連續(xù)的脫氫去飽和生成第一個(gè)有色類(lèi)胡蘿卜素—番茄紅素。在細(xì)菌和植物質(zhì)體中番茄紅素是通過(guò)MEP途徑合成的:由糖酵解途徑合成的甘油醛－3－磷酸(G3P)和丙酮酸(Pyr)通過(guò)1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸合酶(DXS)催化縮合生成1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸(DXP)，DXP由1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)催化生成2－C－甲基－D－赤蘚糖－4－磷酸(MEP)，MEP再經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)最后生成異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲?；沽姿?DMAPP)［4－6］。具體代謝途徑如圖1所示:

1.2 番茄紅素在重組大腸桿菌中的生物合成途徑 和其他微生物相比，大腸桿菌具有生長(zhǎng)快、遺傳背景清楚、基因操作方便等優(yōu)點(diǎn)，已成為番茄紅素生產(chǎn)的首選菌株。大腸桿菌本身不能合成番茄紅素，但TCA循環(huán)的中間體如蘋(píng)果酸、草酰乙酸等可以形成類(lèi)胡蘿卜素和脂類(lèi)物質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)含有的成分如多萜醇、苯醌等化合物和番茄紅素一樣也都是由共同的前體IPP轉(zhuǎn)化而來(lái)。野生型大腸桿菌只能將IPP轉(zhuǎn)化成GGPP，而缺乏必要的酶將GGPP轉(zhuǎn)化成番茄紅素。研究表明只要將三個(gè)番茄紅素合成酶的基因(crtE、crtB和crtI)導(dǎo)入大腸桿菌就可以最終建立番茄紅素的生物合成途徑(圖2)［7～9］。其中crtE編碼GGPP合酶，引入crtE可以增加FPP向GGPP的轉(zhuǎn)化;crtB編碼八氫番茄紅素合成酶，可將GGPP轉(zhuǎn)化成八氫番茄紅素;而crtI編碼八氫番茄紅素脫氫酶，能促使八氫番茄紅素向番茄紅素轉(zhuǎn)化。

圖2 番茄紅素在大腸桿菌中的生物合成途徑

CDP－ME:4－二磷酸－2C－甲基－D－赤蘚糖;CDPMEP:4－二磷酸－2C－甲基－D－赤蘚糖－2－磷酸;ME－cPP:2C－甲基－D－赤蘚糖－2，4－環(huán)二磷酸;HMBPP:4－羥基－3－甲基－2－丁烯基－4－二磷酸;IspC－IspH:異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲?；沽姿?DMAPP)的合成酶;plasmid(pAC－LYC):含有crtE、crtB和crtI基因的質(zhì)粒;other isoprenoids:其他類(lèi)異戊二烯。

2 利用代謝工程構(gòu)建重組大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素

為達(dá)到利用大腸桿菌高效生產(chǎn)番茄紅素的目的，需要對(duì)番茄紅素的代謝途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化。一般先要找到影響目標(biāo)代謝流的關(guān)鍵基因，利用基因工程的方法使其過(guò)量表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行抑制或敲除等，但由于番茄紅素的合成涉及菌體內(nèi)的多步酶催化反應(yīng)，所以往往需要對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行操作。重組工程菌構(gòu)建完成后，還可通過(guò)微生物培養(yǎng)工程的系統(tǒng)優(yōu)化進(jìn)一步提高番茄紅素的生產(chǎn)能力。利用代謝工程和發(fā)酵工程的方法提高番茄紅素產(chǎn)量一般有以下幾種方法:①同源基因的原位取代;②代謝旁路基因的敲除;③代謝途徑關(guān)鍵基因的過(guò)量表達(dá);④多基因的協(xié)同調(diào)控;⑤工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

2.1 同源基因的原位取代 同源基因是來(lái)自同一物種或不同但相關(guān)物種的、在進(jìn)化過(guò)程中源于共同祖先的基因，是在進(jìn)化過(guò)程中特定基因在不同物種間的轉(zhuǎn)移和重排所產(chǎn)生的結(jié)果，這種基因演化是微生物進(jìn)化的強(qiáng)大推動(dòng)力。選取高酶活同源基因?qū)Υx途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行原位取代是代謝工程研究中的常用手段。

大腸桿菌引入crtE、crtB和crtI三個(gè)關(guān)鍵基因后使得代謝流導(dǎo)向番茄紅素的合成，而這三個(gè)基因來(lái)源的不同會(huì)對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量產(chǎn)生明顯影響。Ju－Eun Kim等［10］發(fā)現(xiàn)當(dāng)crt基因來(lái)源于Pantoea agglomerans時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量可以達(dá)到27 mg·L－1，而當(dāng)crt基因來(lái)源于Pantoea ananatis時(shí)，番茄紅素的產(chǎn)量只有12 mg·L－1。研究表明，番茄紅素產(chǎn)量的差異主要是crtE基因引起的，crtE編碼的GGPP合酶可以增加FPP向GGPP的轉(zhuǎn)化，是番茄紅素合成途徑的限速酶。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Pantoea agglomerans來(lái)源的crtE基因具有更高的活性，有利于提高番茄紅素的產(chǎn)量。IPP和它的同分異構(gòu)體DMAPP是番茄紅素合成的重要前體，idi編碼的IPP異構(gòu)酶有助于維持IPP和DMAPP之間的代謝平衡，在番茄紅素合成途徑中扮演著重要角色。Albermann等［11］用來(lái)源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的idi基因替換大腸桿菌的idi基因，可以提高重組菌產(chǎn)番茄紅素的能力。來(lái)源于大腸桿菌和地衣芽孢桿菌idi基因的大小分別為549 bp和1 050 bp，編碼的氨基酸序列相似度只有6%。這說(shuō)明了異種同源基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生歧化從而導(dǎo)致他們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上某種程度的差異，選用合適來(lái)源的酶對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化具有重要的意義。

2.2 代謝途徑旁路基因的敲除 通過(guò)旁路代謝途徑基因的敲除增加目的產(chǎn)物的代謝流量是代謝工程的常用方法之一。微生物體內(nèi)代謝途徑非常復(fù)雜，除目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑外，許多旁路代謝流對(duì)微生物的生長(zhǎng)都有重要的作用。如果為了加強(qiáng)產(chǎn)物合成代謝流而任意敲除旁路代謝基因往往會(huì)影響菌體的正常生理功能導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量的下降，所以找到合適的待敲除基因是整個(gè)旁路代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的首要任務(wù)。

Stephanopoulos課題組［12］根據(jù)重組大腸桿菌整體代謝網(wǎng)絡(luò)，建立了一個(gè)代謝通量計(jì)算模型，通過(guò)對(duì)全基因組范圍的代謝通量平衡分析和基因敲除模擬計(jì)算，篩選出了6個(gè)目標(biāo)基因靶點(diǎn)(gdhA、gpmA、gpmB、aceE、fdhF和talB)。經(jīng)過(guò)單基因，雙基因和三基因組合敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除gdhA、aceE和fdhF三個(gè)基因能使番茄紅素的產(chǎn)量提高近40%。其中，gdhA編碼谷氨酸脫氫酶，催化α－酮戊二酸和NADPH轉(zhuǎn)化為谷氨酸，敲除gdhA可以增加前體NADPH的供應(yīng)量。aceE編碼丙酮酸脫氫酶，敲除aceE能阻止丙酮酸流向乙酰輔酶A的合成，從而增加前體物質(zhì)丙酮酸的量。fdhF編碼甲醛脫氫酶，催化甲醛轉(zhuǎn)化為CO2和H2O，敲除fdhF可減少丙酮酸流向甲醛及其他副產(chǎn)物，結(jié)果同樣是增加丙酮酸的量而促進(jìn)番茄紅素的合成。翁志明等［13］選擇BW25113作為基因敲除的起始菌，利用Red重組技術(shù)分別對(duì)gdhA、fdhF和aceE這三個(gè)基因進(jìn)行敲除，結(jié)果表明基因型為 ΔgdhAΔaceE和ΔgdhAΔfdhFΔaceE的兩種菌株合成番茄紅素的能力最強(qiáng)，番茄紅素產(chǎn)量分別為3.8 mg·g DCW－1和3.6 mg·gDCW－1。ackA－pta可以催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸，Vadali等［14］發(fā)現(xiàn)敲除ackA－pta基因可以將番茄紅素產(chǎn)量提高約45%。ackA－pta基因的敲除一方面可以降低乙酰輔酶A的消耗，從而減弱了丙酮酸流向乙酰輔酶A的代謝流;另一方面還可以降低乙酸的積累可以減弱其對(duì)菌體生長(zhǎng)的不利影響。在此基礎(chǔ)上通過(guò)鏈霉菌甲羥戊酸途徑的引入，提高了番茄紅素前體IPP的含量，進(jìn)一步將番茄紅素的產(chǎn)量提高了1倍。

2.3 代謝途徑關(guān)鍵基因的過(guò)量表達(dá) 番茄紅素代謝途徑中一些前體物質(zhì)的積累有利于番茄紅素的合成，這些物質(zhì)可以通過(guò)相關(guān)酶的過(guò)量表達(dá)來(lái)增加其含量，以滿足番茄紅素高效合成的需求。idi基因編碼代謝途徑中的IPP異構(gòu)化酶，能夠促進(jìn)IPP向DMAPP的轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)這兩個(gè)代謝中間產(chǎn)物的平衡。而ispA是中間產(chǎn)物FPP合成酶基因，idi或ispA的過(guò)量表達(dá)或兩者同時(shí)過(guò)量表達(dá)均可使番茄紅素產(chǎn)量得到提高，其中同時(shí)過(guò)量表達(dá)idi和ispA時(shí)番茄紅素產(chǎn)量比原始菌提高了69%［15］。Kang等［16］利用鳥(niǎo)槍法分析大腸桿菌基因組發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)dxs、crl、rpoS和appY均可以促進(jìn)重組大腸桿菌番茄紅素的合成。其中dxs是MEP途徑的關(guān)鍵酶基因，其過(guò)量表達(dá)使得流向IPP的代謝流增強(qiáng)，直接提高關(guān)鍵前體IPP的量;crl編碼細(xì)胞表面纖維蛋白，增大外膜空間有利于番茄紅素的儲(chǔ)存;rpoS編碼σs因子，σs因子為RNA聚合酶的亞基，起到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用;appY編碼能量代謝調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)dxs或appY時(shí)番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)到2.8 mg·gDCW－1，而當(dāng)dxs分別同其他三個(gè)基因一起過(guò)量表達(dá)時(shí)，均比單獨(dú)過(guò)量表達(dá) dxs效果好。此外，Jin和Stephanopoulos［17］通過(guò)基因組合分析又發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)yjiD、ycgW、yhbL、purDH和yggT也可以提高番茄紅素的產(chǎn)量。研究將旁路基因的敲除和限速基因的過(guò)量表達(dá)結(jié)合運(yùn)用，篩選到一株基因型為WS140(T5p－dxs，T5p－idi，rrnBp－yjiD－ycgW，ΔgdhAΔaceEΔfdhF，pACLYC)的菌株，產(chǎn)番茄紅素的量是原始菌的4倍，達(dá)到了16 mg·gDCW－1。用生物信息學(xué)的方法線性規(guī)劃細(xì)胞生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生成速率可顯示能增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的代謝流，Choi等［18］在此基礎(chǔ)上結(jié)合基因敲除和啟動(dòng)子替換等方法構(gòu)建了一株重組菌WLGB－RPP (pTrcDx－idi－mdh，pLyc184)將番茄紅素的產(chǎn)量提高到了283 mg·L－1。

2.4 代謝途徑多基因協(xié)同調(diào)控 微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物的最終合成需要經(jīng)過(guò)一系列的轉(zhuǎn)化，而各步反應(yīng)間的代謝流存在相互影響和制約的作用，因此只對(duì)若干個(gè)基因進(jìn)行操作將難以達(dá)到全面發(fā)掘與提升產(chǎn)物合成能力的目標(biāo)。Wang等［19］以番茄紅素生物合成途徑的20種關(guān)鍵基因(dxs、dxr、ispD、ispE、ispG、ispH、idi、ispA、appY、rpoS、crl、elbA、elbB、yjiD、purH、rnlA、yggT、ycgZ、ymgA、ariR)為研究目標(biāo)，建立了一種能對(duì)大量基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行同時(shí)調(diào)控的方法(MAGE)。針對(duì)這20種基因的SD序列進(jìn)行研究，首先化學(xué)合成了轉(zhuǎn)錄效率不等的SD序列基因庫(kù)，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將基因庫(kù)導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用同源重組技術(shù)隨機(jī)替換目標(biāo)SD序列，實(shí)現(xiàn)了對(duì)全部基因轉(zhuǎn)錄水平的整體調(diào)控。該實(shí)驗(yàn)在3天之內(nèi)就篩選到了一株番茄紅素產(chǎn)量提升5倍的突變株，分析表明由于該突變株的dxs和idi基因的轉(zhuǎn)錄水平得到了增強(qiáng)使得番茄紅素產(chǎn)量大幅提高。

2.5 通過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化提高產(chǎn)量 不同的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)微生物菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成都會(huì)產(chǎn)生影響。番茄紅素為脂溶性物質(zhì)，一般都積累在細(xì)胞膜上，這在一定程度上改變了細(xì)胞表面的形狀，使細(xì)胞產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。表面活性劑可以有效地減少表面張力，使細(xì)胞分散，從而改善菌體的生長(zhǎng)狀況。Yoon等［20］通過(guò)在培養(yǎng)基中添加表面活性劑吐溫80將番茄紅素的產(chǎn)量提高了27%。碳源在大腸桿菌中的運(yùn)輸方式主要有兩種:磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴型和非磷酸烯醇式丙酮酸依賴型。Jongrae Kim等［21］研究了三種磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴型附加碳源(葡萄糖、甘露糖和麥芽糖)和三種非磷酸烯醇式丙酮酸依賴型碳源(甘油、半乳糖和乳糖)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明甘油為附加碳源時(shí)的產(chǎn)量最高，是葡萄糖做為附加碳源時(shí)的30倍。Yeong－Su Kim等［22］也對(duì)工程菌E.coli K12的培養(yǎng)基碳源進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在含有甘油的培養(yǎng)基中加入10 mg·L－1葡萄糖和7.5 mg·L－1的L－阿拉伯糖發(fā)酵34 h時(shí)可使番茄紅素的產(chǎn)量提高到1 350 mg·L－1，比未優(yōu)化培養(yǎng)基提高了7.1倍。除了碳源，培養(yǎng)溫度對(duì)番茄紅素產(chǎn)量也會(huì)產(chǎn)生影響，有報(bào)道相對(duì)低的溫度(20～30℃)培養(yǎng)更有利于番茄紅素的積累［14，23，24］，但是此時(shí)菌體的生長(zhǎng)卻相對(duì)緩慢，會(huì)因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而影響經(jīng)濟(jì)效益。運(yùn)用溫度梯度培養(yǎng)可以有效地解決這一矛盾，Kim等［25］將工程菌E.coli DH5α先在37℃下培養(yǎng)，20 h后轉(zhuǎn)移到25℃，在此期間補(bǔ)加甘油作為碳源和阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，60 h后番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)到260 mg· L－1，比一直在25℃條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)量提高了20%。

3 總結(jié)與展望

利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素已經(jīng)成為研究的重要發(fā)展方向，通過(guò)對(duì)番茄紅素代謝網(wǎng)絡(luò)的全面研究，可以有效地指導(dǎo)生物合成途徑的遺傳修飾，從而提高番茄紅素的生產(chǎn)能力。但和番茄紅素合成相關(guān)的酶大多分布于脂膜上，在非膜環(huán)境下很容易失去活性，使得番茄紅素代謝網(wǎng)絡(luò)的酶學(xué)研究變得十分困難。不僅如此，番茄紅素的最終合成涉及一系列步驟的反應(yīng)，各步反應(yīng)之間相互聯(lián)系，互為影響，如何使之更好的協(xié)同作用來(lái)提高番茄紅素的合成能力也是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，對(duì)基因工程菌的基因轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，測(cè)定番茄紅素生產(chǎn)過(guò)程中多基因轉(zhuǎn)錄變化情況，研究關(guān)鍵基因群及其作用機(jī)理，在深入理解代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成和調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過(guò)有效協(xié)同抑制各代謝支流及增強(qiáng)目標(biāo)代謝流，進(jìn)一步提高番茄紅素產(chǎn)量，將成為利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的新的研究方向之一。

［1］ Qu MY，Zhou Z，Chen CH，et al.Lycopene protects against trimethyltin－induced neurotoxicity in primary cultured rat hippocampal neurons by inhibiting the mitochondrial apoptotic pathway［J］.Neurochem Int，2011，59(8):1095－ 1103.

［2］ Lu R，Dan H，Wu R，et al.Lycopene:Features and potential significance in the oral cancer and precancerous lesions［J］.J Oral Pathol Med，2011，40(5):361－368.

［3］ Omoni AO，Aluko RE.The anticarcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene:a review［J］.Trends Food Sci Tech，2005，16(8):344－350.

［4］ Hirschberg J.Carotenoid biosynthesis in flowering plants［J］.Curr Opin Plant Boil，2001，4(3):210－218.

［5］ Ronen G，Cohen M，Zamir D，et al.Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato fruit development:expression of the gene for lycopene epsilon－cyclase is downregulated during ripening and is elevated in the mutant Delta［J］.Plant J，1999，17(4):341－351.

［6］ Rohmer M.The discovery of a mevalonate－independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria，algae and higher plants［J］.Nat Prod Rep，1999，16(5):565－574.

［7］ Rohdich F，Hecht S，G?rtner K，et al.Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway:metabolic role of IspH(LytB)protein［J］.P Natl Acad Sci，2002，99(3): 1158－1163.

［8］ Cunningham FX，Gantt E.A portfolio of plasmids for identification and analysis of carotenoid pathway enzymes:A－donis aestivalis as a case study［J］.Photosynth Res，2007，92(2):245－259.

［9］ Harada H，Misawa N.Novel approaches and achievements in biosynthesis of functional isoprenoids in Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，84(6):1021－1031.

［10］Yoon SH，Kim JE，Lee SH，et al.Engineering the lycopene synthetic pathway in E.coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(1):131－139.

［11］Rad SA，Zahiri HS，Noghabi KA，et al.Type 2 IDI performs better than type 1 for improving lycopene production in metabolically engineered E.coli strains［J］.World J Microbiol Biotechnol，2012，28(1):313－321.

［12］Alper H，Jin YS，Moxley JF，et al.Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis in Escherichia coli［J］.Metab Eng，2005，7(3):155－164.

［13］Liu JZ，Weng ZM，Wang Y，et al.Metabolic engineering based on systems biology for chemicals production［J］.Front Biol，2009，4(3):260－265.

［14］Vadali RV，F(xiàn)u Y，Bennett GN，et al.Enhanced lycopene productivity by manipulation of carbon flow to isopentenyl diphosphate in Escherichia coli［J］.Biotechnol Prog，2005，21(5):1558－1561.

［15］盧韋.大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)番茄紅素研究［D］.北京:首都師范大學(xué)，2007:47－52.

［16］Kang MJ，Lee YM，Yoon SH，et al.Identification of genes affecting lycopene accumulation in Escherichia coli using a shot－gun method［J］.Biotechnol Bioeng，2005，91(5): 636－642.

［17］Jin YS，Stephanopoulos G.Multi－dimensional gene target search for improving lycopene biosynthesis in Escherichia coli［J］.Metab Eng，2007，9(4):337－347.

［18］Choi HS，Lee SY，Kim TY，et al.In silico identification of gene amplification targets for improvement of lycopeneProduction［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(10):3097－3105.

［19］Wang HH，Isaacs FJ，Carr PA，et al.Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution［J］.Nat Lett，2009，460(7257):894－898.

［20］Yoon SH，Lee YM，Kim JE，et al.Enhanced lycopene production in Escherichia coli engineered to synthesize isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate［J］.Biotechnol Bioeng，2006，94(6):1025－1032.

［21］Kim J，Kong MK，Lee SY，et al.Carbon sources－dependent carotenoid production in metabolically engineered Escherichia coli［J］.World J Microbiol Biotechnol，2010，26(12):2231－2239.

［22］Kim YS，Lee JH，Kim NH，et al.Increase of lycopene production by supplementing auxiliary carbon sources in metabolically engineered Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，90(2):489－497.

［23］Lee PC，Mijts BN，Schmidt－Dannert C.Investigation of factors influencing production of the monocyclic carotenoid torulene in metabolically engineered Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，65(5):538－546.

［24］Kim SW，Kim JB，Jung WH，et al.Over－production of beta－carotene from metabolically engineered Escherichia coli［J］.Biotechnol Lett，2006，28(12):897－904.

［25］Kim SW，Kim JB，Ryu JM，et al.High－level production of lycopene in metabolically engineered E.coli［J］.Process Biochem，2009，44(8):899－905.