畢 玲，葛庚芝，賴雁平，于樹(shù)云，司 進(jìn)，李 彬，張貴生

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

銅綠假單胞菌(PAE)廣泛分布于自然界及健康人的皮膚、腸道和呼吸道，當(dāng)人體免疫力降低、嚴(yán)重創(chuàng)傷或進(jìn)行創(chuàng)傷性醫(yī)療操作時(shí)容易引起內(nèi)源性感染［1］，是下呼吸道感染的重要病原體［2］。氨基糖苷類藥物為廣譜抗生素，一直與β-內(nèi)酰胺類合用作為治療PAE感染的一線藥物［3］。隨著氨基糖苷類藥物的長(zhǎng)期使用，PAE對(duì)這類藥物的耐藥率明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，其耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生AMEs、16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷類藥物作用靶位16S rRNA基因突變，以產(chǎn)生AMEs為常見(jiàn)［4］。16S rRNA甲基化酶首次發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)氨基糖苷的放線菌中，近年來(lái)在人類致病菌中亦相繼報(bào)道了這一機(jī)制介導(dǎo)的高水平氨基糖苷類耐藥［5］。為調(diào)查對(duì)氨基糖苷類耐藥的PAE下呼吸道感染分離株中與耐藥相關(guān)的氨基糖苷類修飾酶(AMEs)基因和16S rRNA甲基化酶基因(以下簡(jiǎn)稱甲基化酶基因)的存在狀況，2009～2010年，我們收集了從下呼吸道感染患者合格痰標(biāo)本中分離的對(duì)臨床常用氨基糖苷類藥物耐藥的52株P(guān)AE，檢測(cè)了6種AMEs基因及6種甲基化酶基因，旨在探討下呼吸道感染分離的PAE對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 52株P(guān)AE分離自下呼吸道感染患者合格痰標(biāo)本(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院32株，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院20株)，經(jīng)K-B法證實(shí)對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星及奈替米星中至少1種藥物耐藥，結(jié)果判讀依照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)2008年版標(biāo)準(zhǔn)。半數(shù)抑菌濃度(MIC50)分別為1 024、128、16和＞1 024 mg/L，均以AMS-60全自動(dòng)微生物分析儀鑒定到種。培養(yǎng)基購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器有Thermomixer恒溫振蕩儀、Centrifuge 5415D離心機(jī)、PCR儀及微量移液器，DYY-6D型電泳儀，GELDOC-200型凝膠成像系統(tǒng)。主要試劑為Premix Taq、DNA marker (DL 1 000)及6×Loading Buffer(大連TaKaRa生物技術(shù)公司)，PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 PCR擴(kuò)增模板制備及耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法制備PCR擴(kuò)增模板。取1.5 mL離心管加入200 μL、滅菌去離子水，刮取血平板上培養(yǎng)16～18 h的菌落，充分振蕩混勻后達(dá)到5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫龋?8℃恒溫振蕩加熱10 min，12 000 r/min離心6 min，吸取上清液－20℃保存?zhèn)溆?。PCR法檢測(cè)52株P(guān)AE的6種AMEs基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2″)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ，并檢測(cè)其中25株對(duì)4種藥物全部耐藥菌株(泛耐藥菌)的甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA。aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰ和npmA基因使用文獻(xiàn)［6］的 PCR引物，其他基因的PCR引物使用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系:Premix Taq酶12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加滅菌去離子水至25 μL。去離子水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)為:93℃預(yù)變性3 min，然后93℃變性30 s→退火30 s→72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)72℃延長(zhǎng)至5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以DL 1 000為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用1%瓊脂糖凝膠在10 V/cm電壓下電泳20～30 min，用凝膠成像系統(tǒng)于紫外燈下觀察結(jié)果，Quantity One軟件分析PCR產(chǎn)物并照相保存。

表1 6種AMEs基因和6種16S rRNA甲基化酶基因PCR引物

1.3 陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序及分析 各種基因的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物各取1株送華大基因科技公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件讀序后與GenBank中已發(fā)布的序列做BLASTn比對(duì)，判斷其同源性。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢出情況 52株P(guān)AE的耐藥譜及耐藥基因分布見(jiàn)表2。52株P(guān)AE中aac(3)-Ⅱ、aac (6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ和ant(2″)-Ⅰ基因檢出率分別為53.8%(28/52)、51.9%(27/52)、40.4%(21/ 52)和21.2%(11/52)，未檢出ant(3″)-Ⅰ和aph (3')-Ⅵ基因。AMEs基因總檢出率為92.3%(48/ 52)。其中4株未檢出AMEs基因，19株檢出一種AMEs基因，19株檢出兩種AMEs基因，10株檢出三種AMEs基因。泛耐藥菌株中rmtB基因的檢出率為52.0%(13/25)，未檢出其他甲基化酶基因。aac (3)-Ⅱ基因和aac(6')-Ⅰb基因的PCR產(chǎn)物電泳圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

表2 52株P(guān)AE的耐藥譜及耐藥基因分布

圖1 aac(3)-Ⅱ基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 aac(6')-Ⅰb基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 測(cè)序及序列分析結(jié)果 aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2″)-Ⅰ和rmtB的陽(yáng)性產(chǎn)物序列分別與Gen-Bank登錄號(hào)為HQ705763、HM366563、GU966683和 FJ483516的基因序列具有100% 的同源性;aac(3)-Ⅱ陽(yáng)性產(chǎn)物序列與GenBank登錄號(hào)為AF466526的基因序列具有98%的同源性，存在四處堿基置換突變，翻譯成氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)其中兩處為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第78位賴氨酸被谷氨酸取代、第84位脯氨酸被亮氨酸取代，另外兩處為同義突變，氨基酸序列同源性為97%。aac(6')-Ⅱ基因和rmtB基因的陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序圖分別見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 aac(6')-Ⅱ基因陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序圖(部分)

圖4 rmtB基因陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序圖(部分)

3 討論

氨基糖苷類藥物通過(guò)與細(xì)菌30 S核糖體亞基高度保守的A位點(diǎn)不可逆地結(jié)合抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。細(xì)菌產(chǎn)生的AMEs能夠?qū)Π被擒疹愃幬锓肿又刑囟ǖ陌被土u基進(jìn)行共價(jià)修飾使得藥物與細(xì)菌核糖體的結(jié)合能力大大降低［7］，從而導(dǎo)致耐藥。AMEs按其催化的反應(yīng)類型可分為乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)三大類，每一類酶中又有許多亞類能修飾不同位置上的氨基或羥基而使細(xì)菌產(chǎn)生不同的耐藥表型。

AMEs滅活氨基糖苷類藥物的機(jī)制非常復(fù)雜。由于不同的氨基糖苷類藥物可具有相同的AMEs作用靶位，因而一種AMEs可以滅活多種氨基糖苷類藥物;由于一種氨基糖苷類藥物的分子結(jié)構(gòu)中可存在多個(gè)AMEs作用靶位，因而不同種類的AMEs又可以滅活同種氨基糖苷類藥物。

目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)50種AMEs，其中已報(bào)道在銅綠假單胞菌中存在的有10多種，最常見(jiàn)的是AAC (6')-Ⅱ和ANT(2″)-Ⅰ［8］。本組PAE菌株中AMEs基因的總檢出率為92.3%，共檢出4種AMEs基因，其中aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb和aac(6')-Ⅱ?yàn)榱餍谢?，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［1，9，10］報(bào)道的流行基因型有一定差別，可能與各地區(qū)常用的氨基糖苷類藥物不同有關(guān)。

本組多數(shù)菌株的耐藥表型與其基因型相符。值得注意的是，雖然AAC(6')-Ⅰb能修飾阿米卡星藥物分子，但本組中除了有3株只攜帶aac(6')-Ⅰb的菌對(duì)阿米卡星耐藥之外，9株只攜帶aac(6')-Ⅰb和6株同時(shí)攜帶另外一種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的菌均對(duì)阿米卡星敏感，而5株同時(shí)攜帶核苷轉(zhuǎn)移酶基因和1株同時(shí)攜帶另外兩種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的菌均對(duì)阿米卡星耐藥，提示AAC(6')-Ⅰb往往需要與核苷轉(zhuǎn)移酶或另外兩種乙酰轉(zhuǎn)移酶同時(shí)作用才能引發(fā)對(duì)阿米卡星耐藥。本組中有6株菌只檢出對(duì)慶大霉素沒(méi)有修飾作用的aac(6')-Ⅰb但對(duì)慶大霉素耐藥，有2株菌只檢出對(duì)阿米卡星沒(méi)有修飾作用的aac(3)-Ⅱ和aac(6')-Ⅱ但對(duì)阿米卡星耐藥，另外還有4株耐藥菌未檢出測(cè)試的AMEs基因，可能是因?yàn)榫陻y帶其他不常見(jiàn)的AMEs基因、藥物外排泵表達(dá)增強(qiáng)、發(fā)生藥物作用靶位基因突變或核糖體蛋白編碼基因突變等，尚有待進(jìn)一步研究。

本組aac(3)-Ⅱ陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序菌株只檢出aac (3)-Ⅱ1種耐藥基因，但對(duì)慶大霉素和奈替米星均呈高水平耐藥(MIC值均＞1 024 mg/L)。其測(cè)序結(jié)果翻譯成氨基酸序列后與 GenBank登錄號(hào)為AF466526的基因序列相應(yīng)的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)存在兩處錯(cuò)義突變，即第78位賴氨酸被谷氨酸取代、第84位脯氨酸被亮氨酸取代。兩處突變從單個(gè)氨基酸殘基上來(lái)分析，賴氨酸→谷氨酸可使AAC (3)-Ⅱ修飾酶在相同的pH條件下負(fù)電荷數(shù)目增多，與帶正電荷的氨基糖苷抗生素作用增強(qiáng)，使菌株表現(xiàn)為高水平耐藥。而第84位脯氨酸→亮氨酸會(huì)改變AAC(3)-Ⅱ修飾酶保守區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使酶的活性發(fā)生變化［11］。

rmtB基因首次發(fā)現(xiàn)是分離自日本的一株黏質(zhì)沙雷菌［12］。本組PAE中只檢出rmtB 1種甲基化酶基因，與文獻(xiàn)［9，10］報(bào)道相同。4種氨基糖苷類藥物對(duì)所有rmtB陽(yáng)性菌株的MIC值均＞1 024 mg/L，呈現(xiàn)高水平泛耐藥。MIC值均＞1 024 mg/L的16株高水平泛耐藥菌中有13株檢出 rmtB基因，占81.3%，提示導(dǎo)致下呼吸道感染的氨基糖苷類耐藥PAE對(duì)氨基糖苷類高水平泛耐藥主要與rmtB有關(guān)。

由于AMEs基因和16S rRNA甲基化酶基因大多是由質(zhì)粒、整合子及轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)，易于在細(xì)菌之間傳播［9］，從而造成耐藥菌株的播散。加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌耐藥的監(jiān)測(cè)和耐藥基因的流行病學(xué)調(diào)查有助于了解耐藥菌株的傳播規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物、有效控制醫(yī)院感染、控制耐藥菌株的播散以及指導(dǎo)抗菌藥物的研發(fā)方向均有重要意義。

［1］史偉峰，王玉月，何彩珍，等.銅綠假單胞菌氨基糖苷類藥物修飾酶基因研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2007，22(1):67-70.

［2］王一兵，李衛(wèi)光，朱其鳳.山東省醫(yī)院感染控制網(wǎng)下呼吸道感染病原菌分布及耐藥分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15 (5):490-492.

［3］顧覺(jué)奮.抗生素的合理應(yīng)用［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004:55-67.

［4］Doi Y，Arakawa Y.16S Ribosomal RNA Methylation:Emerging Resistance Mechanism against Aminoglycosides［J］.Clin Infect Dis，2007，45(1):88-94.

［5］吳瓊，倪語(yǔ)星.一種新的氨基糖苷類耐藥決定因子—質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶［J］.微生物與感染，2009，4(1):45-48，58.

［6］糜祖煌，陸亞華.氨基糖苷類修飾酶及其基因檢測(cè)［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2004，16(1):13-14.

［7］鄭衛(wèi).氨基糖苷類抗生素研究的新進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥:抗生素分冊(cè)，2005，26(3):101-110.

［8］Poole K.Aminoglycoside resistance in pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):479-487.

［9］汪宏良，鄒義春，柯俊，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶基因研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(11):1505-1508.

［10］糜祖煌，秦玲.泛耐藥銅綠假單胞菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶基因研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18 (12):1656-1658.

［11］陳接根，呂建新，樓永良，等.大腸埃希菌氨基糖苷類耐藥株aac (3)-Ⅱ基因保守區(qū)分析［J］.遺傳，2004，26(2):202-204.

［12］Doi Y，Yokoyama K，Yamane K，et al.Plasmid-mediated 16S rRNA methylase in Serratia marcescens conferring high-level resistance to aminoglycosides［J］.Ant Agents Chem，2004，48(2):491-496.