周慶民 馮萬(wàn)宇 秦 博 黃 健 徐 馨 侯美如

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江省齊齊哈爾市 161006）

不同種類(lèi)的低聚糖對(duì)豬腸道菌群作用效果研究

周慶民 馮萬(wàn)宇 秦 博 黃 健 徐 馨 侯美如

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江省齊齊哈爾市 161006）

為了找到適宜豬有益菌群利用的低聚糖，利用模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境的體外試驗(yàn)研究了含有不同的功能性低聚糖 （水蘇糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖）發(fā)酵液中大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌及其pH值在不同發(fā)酵時(shí)間的變化情況。結(jié)果表明，發(fā)酵24小時(shí)后含糖發(fā)酵液大腸桿菌增加的幅度與無(wú)糖組相比無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。發(fā)酵6和12小時(shí)，各發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量無(wú)顯著差異 （P＞0.05），但發(fā)酵24小時(shí)后，含糖發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加的幅度顯著高于無(wú)糖發(fā)酵液 （P＜0.05），其中含葡萄糖、低聚異麥芽糖和低聚果糖發(fā)酵液中增加的幅度最高，但葡萄糖在消化道中被消化酶分解利用，含糖發(fā)酵液的pH值顯著低于無(wú)糖發(fā)酵液 （P＜0.05）。可見(jiàn)，低聚糖通過(guò)降低腸道pH值并作為有益菌 （雙歧桿菌和乳酸桿菌）的底物促進(jìn)其生長(zhǎng)，以低聚異麥芽糖、低聚果糖效果最佳，但對(duì)大腸桿菌促生長(zhǎng)作用不明顯。

低聚糖；豬；腸道；菌群

低聚糖 （Oligosaccharide）或稱(chēng)寡糖，是由2～10個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈低度聚合糖，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、組成及糖苷鍵的差異。分功能性低聚糖和普通低聚糖兩大類(lèi)，其中功能性低聚糖包括水蘇糖、棉子糖、異麥芽酮糖、乳酮糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖、低聚異麥芽酮糖和低聚龍膽糖等。動(dòng)物胃腸道內(nèi)沒(méi)有水解這些低聚糖的酶系統(tǒng)，因此它們不被消化吸收而直接進(jìn)入大腸內(nèi)優(yōu)先為雙歧桿菌所利用，是雙歧桿菌的增殖因子。功能性低聚糖在進(jìn)入大腸后，都能被腸道菌群選擇性地發(fā)酵，主要是被雙歧桿菌與乳酸菌所利用，不被有害菌利用。它們的主要差異在于被腸道菌群利用程度不同，具體表現(xiàn)在對(duì)不同有益菌增殖程度、有害菌受抑制程度、產(chǎn)酸量和產(chǎn)氣量等方面的差異。因此，我們針對(duì)這些低聚糖的差異特點(diǎn)，模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境對(duì)豬腸道菌群進(jìn)行了體外作用效果試驗(yàn)，以選擇豬最適宜的低聚糖應(yīng)用種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

菌種來(lái)自健康無(wú)胃腸疾病的育成豬腸道大便。

1.1.2低聚糖

低聚糖選擇以下4種：低聚果糖（鄭州景德化工產(chǎn)品有限公司），低聚異麥芽糖 （山東保齡寶生物股份有限公司），低聚木糖 （山東龍力生物科技股份有限公司）和低聚糖水蘇糖 （西安德施普生物制品有限責(zé)任公司）。

1.1.3培養(yǎng)基

GAM（腸道菌群發(fā)酵）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，大豆胨3 g，消化血清粉13.5 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏2.2 g，牛肝膏1.2 g， KH2PO42.5 g，NaCl13 g，可溶性淀粉5 g，L-半胱胺酸鹽0.3 g，硫乙醇酸鈉0.3 g，瓊脂1.5 g，葡萄糖3 g（根據(jù)需要添加），蒸餾水1 000mL，pH 7.2～7.4，121℃滅菌30分鐘。

EMB（大腸桿菌）培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán) 4.5 g，蒸餾水 100 mL，121℃滅菌30分鐘。

LBS（乳酸桿菌）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，葡萄糖2 g，牛肉膏0.6 g，酵母膏0.5 g，吐溫-80 0.1mL，K2HPO40.2 g，MgSO40.02 g，MnSO40.005 g，無(wú)水乙酸鈉1.5 g，檸檬酸三銨0.2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100mL，pH值6.5，121℃滅菌30分鐘。

BS添加液：備100 mL滅菌燒瓶，稱(chēng)30 g丙酸鈉，加80mL水溶解，再加入巴龍霉素0.l g，硫酸新霉素0.4 g，氯化鋰6 g溶解，最后加水至100mL。

改良BS（雙歧桿菌）培養(yǎng)基：西紅柿汁20 mL，蛋白胨1.5 g，酵母膏0.6 g，葡萄糖2 g，NaCl 10.5 g，瓊脂2 g，蒸餾水80 mL，pH值6.8，121℃滅菌30分鐘。冷卻至50℃時(shí)加BS添加液50mL，倒平板。

稀釋液：KH2PO44.5g，Na2HPO46.0g，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，吐溫-80 0.5 g，瓊脂1 g，121℃滅菌30分鐘。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)方法

腸道菌群發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用不同的碳源，設(shè)6個(gè)組，其中2個(gè)對(duì)照組，4個(gè)試驗(yàn)組。培養(yǎng)基以未加葡萄糖的GAM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)照組1培養(yǎng)基中不加葡萄糖，對(duì)照組2培養(yǎng)基中加1%葡萄糖，試驗(yàn)組1～4培養(yǎng)基中分別加1%低聚果糖、1%低聚異麥芽糖、1%低聚木糖和1%低聚糖水蘇糖。每組設(shè)3個(gè)平行樣，每個(gè)樣裝200 mL，共計(jì)分裝18個(gè)培養(yǎng)瓶，加塞并插上針頭，然后121℃滅菌30分鐘，滅菌后拔出針頭，室溫冷卻。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間不同發(fā)酵底物發(fā)酵液菌群數(shù)量變化

無(wú)菌采取健康無(wú)胃腸疾病育成豬新鮮糞便10 g，加入100 mL生理鹽水充分混合，分別取上清液1mL加入18個(gè)培養(yǎng)瓶中，混勻，置恒溫箱培養(yǎng)，37℃發(fā)酵。

發(fā)酵6、12和24小時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的數(shù)量 （測(cè)活菌數(shù)用平板計(jì)數(shù)法）：取發(fā)酵液1mL，加入生理鹽水9mL中充分稀釋?zhuān)偃〈艘? mL，加入生理鹽水9mL中充分稀釋?zhuān)B續(xù)稀釋至10-6取10-4、10-5、10-6滴種，每個(gè)稀釋度分別滴種3滴，大腸桿菌平板直接放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后分別計(jì)數(shù)，雙歧桿菌和乳桿菌平板放入?yún)捬豕拗信囵B(yǎng)48～72小時(shí)后計(jì)數(shù)。同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液pH值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的數(shù)量用其對(duì)數(shù)值表示，采用SPSS 11.0軟件對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間、不同底物同一菌群的數(shù)量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

發(fā)酵6、12和24小時(shí)發(fā)酵液中大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量及其pH值的變化見(jiàn)圖1～2。

從圖1可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中各種菌的數(shù)量均呈上升趨勢(shì)。雖然發(fā)酵6、12和24小時(shí)后含糖發(fā)酵液中大腸桿菌的數(shù)量高于無(wú)糖發(fā)酵液，但含糖發(fā)酵液大腸桿菌增加的幅度與無(wú)糖組相比無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。發(fā)酵6和12小時(shí)，各發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量無(wú)顯著差異 （P＞0.05），但發(fā)酵24小時(shí)，含糖發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著高于無(wú)糖發(fā)酵液 （P＜0.05），其中葡萄糖發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量增加的幅度最高，其次是低聚異麥芽糖和低聚果糖。

從圖2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的pH值均呈下降趨勢(shì)，但含糖發(fā)酵液的pH值顯著低于無(wú)糖發(fā)酵液 （P＜0.05）。

3 討論

圖2不同發(fā)酵時(shí)間不同底物發(fā)酵液pH值變化

發(fā)酵過(guò)程中，含糖發(fā)酵液大腸桿菌增加的幅度與無(wú)糖組相比無(wú)顯著差異，但發(fā)酵24小時(shí)后，含糖發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著高于無(wú)糖發(fā)酵液，其中含葡萄糖、低聚異麥芽糖和低聚果糖發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量增加的幅度最高。葡萄糖在消化道中易被消化酶分解利用，而功能性低聚糖則可以直接進(jìn)入腸道發(fā)揮作用。可見(jiàn)低聚糖可作為有益菌 （雙歧桿菌和乳酸桿菌）的底物促進(jìn)其生長(zhǎng)，并通過(guò)降低腸道pH值，形成不利于病原菌生存的環(huán)境，從而有效抑制腸道腐敗，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)而有利于排便，保證機(jī)體健康，尤以低聚異麥芽糖、低聚果糖效果最佳。

S816.71

A

1673-4645（2012）05-0040-02