王巧真 金真真 彭 挺 管英俊 李 和，＊

（1濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東261042；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，武漢430030）

Aizawa于2004年在鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子時用反式激活因子陷阱（transactivator trap）方法鑒定出一種具有鈣離子依賴性反式激活作用的蛋白質(zhì)，稱為鈣反應(yīng)性反式激活因子（calcium-responsive transactivator， CREST）［1］。CREST是一種反式轉(zhuǎn)錄共激活因子SYT［2］相關(guān)蛋白，在人、大鼠、小鼠間高度同源［1，2］，在腦內(nèi)呈較高水平表達(dá)，主要定位于神經(jīng)元核內(nèi)［1］。腦內(nèi)CREST的表達(dá)與神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)［1］，基因敲除實驗證明，CREST在神經(jīng)元樹突的生長和分支發(fā)育中具有重要作用［1，3］。CREST 與神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)系和在神經(jīng)元樹突生長中的作用提示，CREST與神經(jīng)元的分化有關(guān)，但目前未見CREST與神經(jīng)元分化關(guān)系的報道。為了深入探討CREST在神經(jīng)元分化中的作用，本研究利用在促分化因素作用下具有分化為神經(jīng)元能力的小鼠成神經(jīng)瘤 （N2a）細(xì)胞［4］，檢測了促分化因素?zé)o血清培養(yǎng)［5］對 N2a細(xì)胞CREST表達(dá)的影響。

材料和方法

N2a細(xì)胞（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院病理生理系王建枝教授惠贈）；兔抗CREST（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），小鼠抗微管蛋白γ（γ-tubulin）、Hoechst33258、蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich），辣根過氧化物酶（HRP）耦聯(lián)的驢抗兔IgG、HRP耦聯(lián)的驢抗小鼠IgG和Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories），增強型化學(xué)發(fā)光試 劑 （enhancedchemiluminescence，ECL）、OPTIMEM 和DMEM、胎牛血清 （FBS）（Invitrogen）。

2.細(xì) 胞培養(yǎng)

將N2a細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用DMEM和OPTIMEM 1：1混合的培養(yǎng)基（含5%FBS、100U／ml青霉素G、100μg／ml鏈霉素）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～24h后，將細(xì)胞分為對照組和分化誘導(dǎo)組。對照組繼續(xù)在含5%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化誘導(dǎo)組用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩組細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h和48h。

3.蛋 白免疫印跡分析

培養(yǎng)相應(yīng)時間后，收集細(xì)胞，冰上用細(xì)胞裂解液（50mmol／L Tris-HCL，pH 7.4，150mmol／L NaCL，1%Triton ×-100，1mmol／L EDTA，1 mmol／L PMSF，1∶1000蛋白酶抑制劑混合物）裂解30min，4℃離心（12000rpm／min）5min，取上清用BCA法檢測蛋白濃度，并調(diào)蛋白濃度至2μg／μl。于蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液后，取40μg蛋白用12%SDS-PAGE進行電泳，恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜。室溫下，醋酸纖維膜于含5%脫脂奶粉的0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中封閉抗原1～2h，含5%脫脂奶粉PBS稀釋的第一抗體（兔抗CREST，1∶1000）4℃孵育過夜，含5%脫脂奶粉PBS稀釋的第二抗體（HRP耦聯(lián)的驢抗兔IgG，1∶10000）室溫孵育2h，增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）反應(yīng)5min；全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Bio－Rad XRS＋（Bio-Rad）曝光。接著以同樣方法用小鼠抗γ-tubulin（1∶10000）和 HRP耦聯(lián)的驢抗小鼠IgG （1∶10000）對γ-tubulin進行檢測。

4.C REST的免疫熒光染色

細(xì)胞在放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)相應(yīng)時間后，冷PBS漂洗，0.1mol／L配制的4%多聚甲醛固定10min，含3%Triton×-100的PBS孵育10min，含1%正常驢血清的PBS封閉30min，兔抗CREST 抗體（1：100）4℃孵育過夜，用0.01 mol／L的PBS漂洗3×5min；Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG （1：500）37℃避光孵育2h，10μg／ml的 Hoechst33258，37℃避光孵育30min，取出蓋玻片，以熒光封片劑封片后激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus FV1000）觀察、照像。

5.R T-PCR

培養(yǎng)相應(yīng)時間后，收集細(xì)胞，用Trizol一步法常規(guī)提取總RNA，用紫外分光度計檢測RNA濃度，取2μg總RNA在25μl反應(yīng)體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參對照。CREST引物序列：上游5'-AGATCGGTAACGGTCCAAACCACG-3'，下 游5'-GCATGTTGATGTTGGTCCGAGACAC-3'；βactin引物序 列：上游 5'-TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3'，下游5'-ATAGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3'。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性（94℃，30min），變性（94℃，30sec），退火（55℃，30sec），延伸（72℃，30sec），循環(huán)30次。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10μl在2%瓊脂糖凝膠中120V電泳30min，紫外線下凝膠成像系統(tǒng)（JS-380自動凝膠圖像分析儀）觀察、照像。

6.統(tǒng) 計學(xué)分析

采用IPP5.1圖象分析軟件對RT-PCR和免疫印跡顯示的條帶進行光密度測定，以CREST條帶和內(nèi)參條帶的光密度比值代表其相對水平。各種數(shù)據(jù)均來自至少3次獨立實驗，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，單因素方差分析，用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

結(jié) 果

1.無 血清培養(yǎng)上調(diào)N2a細(xì)胞內(nèi)CREST蛋白水平

免疫印跡檢測顯示（圖1），對照組N2a細(xì)胞CREST蛋白水平在各時間點無明顯變化；分化誘導(dǎo)組N2a細(xì)胞中CREST蛋白水平在無血清培養(yǎng)12h時無明顯變化，在24h時明顯升高，48h時升高更明顯。免疫熒光檢測顯示（圖2），CREST免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核內(nèi)；無血清培養(yǎng)12h后，CREST免疫反應(yīng)產(chǎn)物水平無明顯變化；無血清培養(yǎng)24h和48h后，CREST免疫反應(yīng)產(chǎn)物水平均明顯升高，變化趨勢與免疫印跡檢測結(jié)果相似。

2.無 血清培養(yǎng)上調(diào)N2a細(xì)胞內(nèi)CREST mRNA水平

RT-PCR檢測顯示（圖3），對照組 N2a細(xì)胞CREST mRNA水平在繼續(xù)培養(yǎng)12h和24h后無明顯變化，但在培養(yǎng)48h后略有升高，而分化誘導(dǎo)組細(xì)胞的CREST mRNA水平在無血清培養(yǎng)12h后即已升高，24h和48h后升高更為明顯；在48h時間點，無血清培養(yǎng)的N2a細(xì)胞CREST mRNA水平明顯高于用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)的N2a細(xì)胞。

圖1 無血清培養(yǎng)對N2a細(xì)胞CREST蛋白水平的影響。A，無血清培養(yǎng)對N2a細(xì)胞CREST蛋白水平影響的免疫印跡檢測；＋FBS，含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組細(xì)胞；-FBS，無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的分化誘導(dǎo)組細(xì)胞。B，無血清培養(yǎng)不同時間對N2a細(xì)胞CREST蛋白水平影響免疫印跡檢測的統(tǒng)計學(xué)分析；＊P＜0.01（n＝3）。Fig.1The effect of serum-free culturing on protein level of CREST in N2acells.A，Western blotting detection for the effect of serum-free culturing on protein level of CREST in N2acells；＋FBS，control cells cultured in medium containing FBS；-FBS，differentiation induction cells cultured in medium without FBS.B，statistical analysis of the effect of serum-free culturing on protein level of CREST in N2acells detected by western blotting；＊P＜0.01（n＝3）.

討 論

對不同發(fā)育階段小鼠腦內(nèi)CREST蛋白和mRNA表達(dá)水平的檢測顯示，CREST高表達(dá)于正在分化和分裂后神經(jīng)元內(nèi)，而在胚胎晚期腦室?guī)Ь哂性鲋衬芰Φ某缮窠?jīng)細(xì)胞內(nèi)和成年大鼠腦內(nèi)無表達(dá)或低水平表達(dá)［1］，提示CREST與神經(jīng)元分化有關(guān)。CREST基因敲除小鼠出生后雖然可以存活，但其大腦體積較野生型小鼠顯著縮小，皮質(zhì)神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元樹突生長發(fā)育異常，樹突平均長度及分支都顯著降低；在野生型小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元，去極化可誘導(dǎo)樹突長度增長和分支增加，而在CREST敲除小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元，去極化不能誘導(dǎo)樹突長度增長和分支增加，表明CREST為鈣誘導(dǎo)的樹突生長所必需［1］。在過表達(dá)缺乏核定位結(jié)構(gòu)域的CREST的神經(jīng)元中，由于核內(nèi)CREST同源二聚體減少，去極化誘導(dǎo)的樹突生長因此也被抑制［3］。因此，CREST在神經(jīng)元樹突的生長和分支發(fā)育中具有重要作用。

圖2 無血清培養(yǎng)對N2a細(xì)胞CREST蛋白水平影響的免疫熒光檢測。CREST，不同時間點（0h、12h、24h和48h）對照組（＋FBS）或分化誘導(dǎo)組（-FBS）細(xì)胞CREST的免疫熒光染色 （×600）。Hoechst，對照組或分化誘導(dǎo)組相應(yīng)時間點同一視野細(xì)胞核DNA的Hoechst33342染色。Fig.2Immunofluorescent detection for the effect of serum-free culturing on protein level of CREST in N2acells.CREST，CREST immunofluorescent staining of control（＋FBS）cells or differentiation induction （-FBS）cells at different time points（×600）.Hoechst，Hoechst33342staining of nuclear DNA in control cells or differentiation induction cells of the same fields as CREST immunofluorescent staining at the corresponding time points.

為了揭示CREST與神經(jīng)元分化的關(guān)系，本研究觀察了用無血清培養(yǎng)的N2a細(xì)胞后其CREST蛋白和mRNA水平的變化，結(jié)果顯示，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基培養(yǎng)的N2a細(xì)胞，其CREST蛋白和mRNA水平呈培養(yǎng)時間依賴性增高。在用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)較長時間（48h）的N2a細(xì)胞中，雖然CREST蛋白水平無明顯上調(diào)，但CREST mRNA水平較用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)較短時間（0-24h）的細(xì)胞明顯上調(diào)。此時的CREST mRNA表達(dá)水平上調(diào)可能是隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中FBS含量因消耗而相對缺乏，使N2a細(xì)胞呈一定程度分化的反映。因此，N2a細(xì)胞在促分化因素作用時其CREST的表達(dá)明顯上調(diào)。

圖3 無血清培養(yǎng)對N2a細(xì)胞CREST mRNA水平的影響。A，無血清培養(yǎng)對N2a細(xì)胞CREST mRNA水平影響的RTPCR檢測。B，無血清培養(yǎng)不同時間對N2a細(xì)胞CREST mRNA水平影響RT-PCR檢測的統(tǒng)計學(xué)分析；＊0.01＜P＜0.05（n＝3）；＊＊P＜0.01（n＝3）。Fig.3The effect of serum-free culturing on mRNA level of CREST in N2acells.A，RT-PCR detection for the effect of serum-free culturing on mRNA level of CREST in N2acells.B，statistical analysis of the effect of serum-free culturing on mRNA level of CREST in N2acells detected by RT-PCR；＊0.01＜P＜0.01，compared with control cells（n＝3）；＊＊P＜0.01.

CREST的羧基末端含有核定位信號，其中最后9個氨基酸含有組蛋白乙酰化酶CBP、P300結(jié)合位點［1，3，6］。CBP、p300以及 p300-CBP 轉(zhuǎn)錄共激活因子（p300-CBP-associated factor，PCAF）等可通過促進p53乙?；筽53變得穩(wěn)定和活化［7－11］?；罨膒53能活化周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）抑制劑p21［12，13］，p21通過與CDK4-周期蛋白D1和CDK2-周期蛋白E1等復(fù)合物結(jié)合抑制其活性并由此抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）的磷酸化［13－15］，進而抑制周期蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞分化［16－19］。因此，無血清或低血清培養(yǎng)的 N2a細(xì)胞上調(diào)的CREST可能通過募集更多的CBP、p300及PCAF而活化N2a細(xì)胞內(nèi)的p53，活化的p53通過其下游信號通路抑制細(xì)胞周期，促進其分化。

［1］Aizawa H，Hu SC，Bobb K，et al.Dendrite development regulated by CREST，a calcium-regulated transcriptional activator.Science，2004，303（5655）：197-202

［2］Ladanyi M.Fusions of the SYT and SSX genes in syno-vial sarcoma.Oncogene，2001，20（40）：5755-5762

［3］Pradhan A，Liu Y.A multifunctional domain of the calcium-responsive transactivator （CREST）that inhibits dendritic growth in cultured neurons.J Biol Chem.2005，280（26）：24738-24743

［4］Wu G，F(xiàn)ang Y，Lu ZH.et al.Induction of axon-like and dendrite-like processes in neuroblastoma cells.J Neurocytol，1998，27（1）：1-14

［5］Valero T，Moschopoulou G，Kintzios S，et al.Studies on neuronal differentiation and signalling processes with a novel impedimetric biosensor.Biosens Bioelectron，2010，26（4）：1407-1413

［6］Qiu Z，Ghosh A.A calcium-dependent switch in a CREST-BRG1complex regulates activity-dependent gene expression.Neuron，2008，60（5）：775-787

［7］Grossman S R.p300／CBP／p53interaction and regulation of the p53response.Eur J Biochem，2001，268（10）：2773-2778

［8］Gr?nroos E，Terentiev AA，Punga T，et al.YY1inhibits the activation of the p53tumor suppressor in response to genotoxic stress.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（33）：12165-12170

［9］Roy S，Tenniswood M，Site-specific acetylation of p53 directs selective transcription complex assembly.J Biol Chem，2007，282（7）：4765-4771

［10］Knights C D，Catania J，Di Giovanni S，et al.Distinct p53acetylation cassettes differentially i nfluence geneexpression patterns and cell fate.J Cell Biol，2006，173（4）：533-544

［11］Wang H，Zhao Y，Li L.An ATM-and Rad-related（ATR）signaling pathway and a phosphorylation-acetylation cascade are in-volved in activation of p53／p21Waf1／Cip1in response to 5-aza-2＇-deoxycytidine treatment.J Biol Chem，2008，283（5）：2564-2574

［12］Weiss RH，Randour CJ.The permissive effect of p21（Waf1／Cip1）on DNA synthesis is dependent on cell type：effect is absent in p53-inactive cells.Cell Signal，2000，12（6）：413-418

［13］Zhao Y，Lu S，Wu L.Acetylation of p53at lysine 373／382by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21（Waf1／Cip1）.Mol Cell Biol，2006，26（7）：2782-2790

［14］Ling Y，Chen Y，Chen P，et al.Baicalein potently suppresses angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor through the p53／Rb signaling pathway leading to G1／S cell cycle arrest.Exp Biol Med（Maywood），2011，236（7）：851-859

［15］Dimco G，Knight RA，Latchman DS，et al.STAT1interacts directly with cyclin D1／Cdk4and mediates cell cycle arrest.Cell Cycle，2010，9（23）：4638-4649

［16］Shi H，Chen S，Jin H，et al.Downregulation of MSP58inhibits growth of human colorectal cancer cells via regulation of the cyclin D1-cyclin-dependent kinase 4-p21pathway.Cancer Sci，2009，100（9）：1585-1590

［17］Liu J，Wang Y，Cui J，et al.Ochratoxin A induces oxidative DNA damage and G1phase arrest in human peripheral blood mononuclear cells in vitro.Toxicol Lett，2012，211（2）：164-171

［18］Zhang L，Mori J，Wagg C，et al.Activating cardiac E2F1induces up-regulation of pyruvate dehydrogenase kinase 4in mice on a short term of high fat feeding.FEBS Lett，2012，586（7）：996-1003

［19］Lim S，Kaldis P.Loss of Cdk2and Cdk4induces a switch from proliferation to differentiation in neural stem cells.Stem Cells，2012，30（70）：1002-1114