杜 江 張德軍 王 勇 王運(yùn)杰＊

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110001；2莊河市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，莊河116400）

隨著人口老齡化和平均壽命的延長，老年性癡呆發(fā)病率迅速攀升。血管性癡呆（vascular dementia，VD）是老年期癡呆的常見類型之一，是指缺血缺氧所引起的獲得性智能損害綜合征，是認(rèn)知功能損害為特征的臨床綜合征，嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量［1］。腦內(nèi)海馬是學(xué)習(xí)、記憶的重要結(jié)構(gòu)，大腦皮層及海馬的神經(jīng)元與人的學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)［2］。鹽酸多奈哌齊（Donepezil），臨床上主要用于治療阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），能可逆性地抑制乙酰膽堿酯酶對(duì)乙酰膽堿的水解，使直接參與神經(jīng)傳遞突觸間的乙酰膽堿含量增加，從而改善認(rèn)知功能，近年的研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊能夠顯著改善VD模型小鼠行為學(xué)成績及海馬病理學(xué)變化［3］，但是其藥理作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。細(xì)胞凋亡在缺血缺氧性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，半胱天冬酶-3（Caspase-3）是caspase 級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種誘導(dǎo)因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用［4］，在神經(jīng)系統(tǒng)中caspase-3不僅可以促進(jìn)腦發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的凋亡，還可以促進(jìn)各種因素誘導(dǎo)培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡，caspase-3可能是缺血缺氧神經(jīng)元凋亡的重要效應(yīng)分子［5］，但是其在血管性癡呆小鼠海馬表達(dá)是否發(fā)生變化，鹽酸多奈哌齊是否通過對(duì)其表達(dá)的調(diào)控參與VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善和神經(jīng)元突觸可塑性的保護(hù)作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血－再灌注法制備VD小鼠模型，通過免疫組化和 Western blot方法檢測caspase-3在VD小鼠海馬的表達(dá)變化，利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測試，觀察多奈哌齊對(duì)VD海馬區(qū)caspase-3表達(dá)的影響，探討多奈哌齊對(duì)VD的藥理作用機(jī)制，從而為血管性癡呆的藥物治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.試 劑和儀器

兔抗小鼠caspase-3（購自Santa公司），羊抗兔IgG（購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；S-P免疫組化染色試劑盒與DAB顯色試劑盒（購自武漢博士德），小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置LW-Ⅱ型（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），小鼠電刺激跳臺(tái)儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），鹽酸多奈哌齊（衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司）。

2.動(dòng) 物模型的建立及分組

90只雄性昆明小鼠，體重（30±5）g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組和多奈哌齊治療組，每組30只，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)缺血－再灌注加尾端放血的方法［6］制備VD模型；假手術(shù)組作為對(duì)照，此組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，且尾部不放血；藥物治療組先制備模型，術(shù)后第2天經(jīng)胃管給予鹽酸多奈哌齊3mg／Kg／d，每天1次，共30d；假手術(shù)組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

3.學(xué) 習(xí)、記憶成績測試

術(shù)后第29d，將各組存活小鼠分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測試學(xué)習(xí)成績；術(shù)后第30d測試記憶成績［7］。（1）跳臺(tái)試驗(yàn)：測試裝置為被動(dòng)回避反應(yīng)箱，記錄小鼠首次受電擊后跳上安全臺(tái)所需時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間）、5min內(nèi)跳下圓臺(tái)次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），作為學(xué)習(xí)成績。24h后重復(fù)上述測試，記錄小鼠首次從安全臺(tái)跳至銅柵所需時(shí)問（潛伏時(shí)間）、5min內(nèi)跳下圓臺(tái)次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），作為記憶成績。（2）水迷宮試驗(yàn)：采用小鼠水迷宮試驗(yàn)裝置，盲端有自動(dòng)感應(yīng)裝置，自動(dòng)控制記錄儀記錄數(shù)據(jù)。記錄其游完全程時(shí)間、進(jìn)入盲端次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績。24h后重復(fù)測試上述指標(biāo)作為記憶成績。

4.免 疫組化檢測與觀察

麻醉處死小鼠，取腦組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)乙醇脫水兩次、二甲苯透明、石蠟包埋組織塊，切片，片厚5μm，按SP試劑盒說明書測定caspase-3的表達(dá)，光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察小鼠海馬CAl區(qū)caspase-3的表達(dá)，同時(shí)將結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理。

5.W estern blot檢測與觀察

麻醉處死小鼠，取腦組織，組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，4℃12 000r／min，離心30min，取上清，－80℃保存?zhèn)溆谩２捎每捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)10%SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，兔抗小鼠caspase-3、β-actin（1∶500）孵育2h，羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2h，暗室內(nèi)ECL發(fā)光，X光片顯影、定影，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度測定并分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均光密度比值表示caspase-3蛋白表達(dá)水平。

6.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用ˉx±s表示，單因素方差分析（one way ANOVA）進(jìn)行組間比較，錯(cuò)誤次數(shù)比較應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1.學(xué) 習(xí)、記憶成績

跳臺(tái)試驗(yàn)：VD模型組學(xué)習(xí)和記憶成績均低于假手術(shù)組和多奈哌齊治療組（P＜0.05），而多奈哌齊治療組與假手術(shù)組間差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績（ˉx±s）Table 1 The comparison of the results of mice＇s learning and memory in step-down test in each group（ˉx±s）

水迷宮試驗(yàn)：VD模型組的學(xué)習(xí)成績和記憶成績均低于假手術(shù)組和多奈哌齊治療組（P＜0.05），而多奈哌齊治療組與假手術(shù)組間差異無顯著性（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠水迷宮試驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績比較（ˉx±s）Table 2 The comparison of the results of mice＇s learning and memory in water maze test in each group（ˉx±s）

2.免 疫組化檢測海馬caspase-3的表達(dá)

3組小鼠海馬CAl區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)及平均光密度值比較：與假手術(shù)組（0.25±0.05）和多奈哌齊治療組（0.27±0.04）相比，模型組CAl區(qū)caspase-3免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)及陽性細(xì)胞平均光密度值（0.51±0.08）明顯升高（P＜0.05），而多奈哌齊治療組與假手術(shù)組間差異無顯著性（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CAl區(qū)caspase-3的表達(dá)（×400）A：假手術(shù)組；B：VD模型組；C：多奈哌齊治療組Fig 1.The expression of caspase-3in hippocampus CA1of mice in each group observed by immunochemistry（×400）A：Sham group；B：VD model group；C：Treatment group

3.W estern blot檢測海馬caspase-3的表達(dá)

3組小鼠海馬caspase-3平均光密度值比較：與假手術(shù)組（0.12±0.02）和多奈哌齊治療組（0.13±0.02）相比，模型組小鼠海馬caspase-3平均光密度值與內(nèi)參照β-actin平均光密度的比值（0.27±0.04）明顯升高（P＜0.05），而多奈哌齊治療組與假手術(shù)組間差異無顯著性（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠海馬caspase-3的表達(dá)2A：假手術(shù)組；2B：VD模型組；2C：多奈哌齊治療組Fig 2.The expression of caspase-3in hippocampus of mice in each group observed by wstern blot method 2A：Sham group，2B：VD model group；2C：Treatment group

討 論

VD是指多次反復(fù)發(fā)作的各種腦血管病后逐漸出現(xiàn)的一種漸進(jìn)性、階梯型發(fā)展的認(rèn)知功能障礙綜合癥，臨床上往往以記憶障礙、人格缺損、人格改變、定向力喪失、行為異常、日常社交生活能力低下等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量。鹽酸多奈哌齊（Donepezil，1），化學(xué)名為2，3-二氫-5，6－二甲氧基-2-［（1-芐基4-哌啶基）甲基］-1H 一茚酮鹽酸鹽，是由日本衛(wèi)材制藥公司開發(fā)的第二代高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI），1997年首次在美國上市。本品對(duì)神經(jīng)元乙酰膽堿酯酶有高度選擇性，具有劑量小、半衰期長、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，有研究對(duì)1219例輕、中度VD患者的2個(gè)隨機(jī)對(duì)照研究和3090例VD患者的8個(gè)隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照研究的系統(tǒng)回顧均顯示，多奈哌齊對(duì)VD患者有改善作用［8］，多奈哌齊與尼莫地平聯(lián)合治療能明顯改善老年期血管性癡呆患者的認(rèn)知功能、日常生活能力及社會(huì)活動(dòng)功能，且安全性好［9］，但是，多奈哌齊顯改善血管性癡呆患者的認(rèn)知功能的藥理作用機(jī)制還不十分清楚。

腦內(nèi)海馬是學(xué)習(xí)、記憶的重要結(jié)構(gòu)，大腦皮層及海馬的神經(jīng)元與人的學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)，血管性癡呆是由各種腦血管疾病引起的缺血缺氧而最終導(dǎo)致的獲得性智能損害綜合征，在這過程中海馬細(xì)胞的凋亡扮演著重要的角色。細(xì)胞凋亡是由多因素引起，多分子參與的復(fù)雜過程，受多種蛋白分子調(diào)控，其中半胱天冬酶-3和Bcl-2水平的高低是細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的決定性因素，半胱天冬酶-3是最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在凋亡執(zhí)行階段，負(fù)貴對(duì)全部或者部分關(guān)鍵蛋白進(jìn)行酶切［10］，但是其在血管性癡呆小鼠海馬表達(dá)是否發(fā)生變化，鹽酸多奈哌齊是否通過對(duì)其表達(dá)的調(diào)控參與VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善和神經(jīng)元突觸可塑性的保護(hù)作用尚不清楚。

本研究通過在術(shù)后第29天、第30天，通過跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試，發(fā)現(xiàn)鹽酸多奈哌齊治療組小鼠水迷宮找臺(tái)潛伏期明顯縮短，穿臺(tái)次數(shù)明顯增加，跳臺(tái)試驗(yàn)的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，結(jié)果顯示應(yīng)用多奈哌齊治療的VD小鼠表現(xiàn)為認(rèn)知功能增強(qiáng)；與此同時(shí)，在應(yīng)用免疫組化和western blot方法檢測各組小鼠海馬caspase-3的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊治療組小鼠海馬的caspase-3的表達(dá)顯著低于VD模型組，提示降低VD小鼠海馬的caspase-3的表達(dá)很可能是鹽酸多奈哌齊能夠改善小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能的機(jī)制之一。

［1］晏勇.血管性癡呆的診斷和相關(guān)問題.中華老年心腦血管病雜志，2008，10：32l-323

［2］Lin ZH，Y anYQ，Zhu DN，et al.Protective effects of FBD-an experimental Chinese traditio-nal medicinal formula on memory dysfunction in mice induced by cerebral ischemia-reperfusion.J Ethnopharmacol，2005，97：477-483

［3］王雪笠，呂佩源，馮連元等.血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)元JNK的表達(dá)及意義.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（3）：379-381

［4］Li YH，Gong PL.Neurop rotective effects of dauricine against apop tosis induced by transient focal cerebral ischaemia in rats via a mitochondrial pathway.Clin Exp Pharmacol Physiol.2007，34（3）：177-184

［5］鄭海洪，馮念蘋，梁松嵐等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血再灌注凋亡蛋白Caspase-3的影響.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（4）：27-30

［6］趙建新，田元祥，李國明等.腦缺血再灌注擬血管性癡呆小鼠皮層及海馬細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2000，17（4）：200-202

［7］田元祥，楊牧祥.血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠行為學(xué)變化及醒腦啟智膠囊的影響.中國病理生理雜志，2004，20（6）：1104-1107

［8］Demaerschalk BM.Wingerchuk DM.Treatment of vascular dementia and vascular cognitive impairment.Neurologist，2007，13：37-41

［9］劉艷，趙曉玲，王蕾等.多奈哌齊與尼莫地平聯(lián)合治療老年期血管性癡呆的臨床觀察.中華老年心腦血管病雜志，2010，12（6）：488-490

［10］于航，賈慶波，王璐.缺血后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠嗽的影響.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009，25（1）：6-9