楊吉平 羅秀成 楊石照 趙朝華 徐 曦

（西安醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，陜西西安710021）

神 經(jīng) 原 纖 維 纏 結(jié) （Neurofibrillary tangle，NFTs）是阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）患者腦內(nèi)特征性的神經(jīng)病理改變之一，可作為大腦早老化的標(biāo)志，多出現(xiàn)在皮層、海馬以及基底前腦的神經(jīng)元中。目前認(rèn)為，NFTs的形成與AD患者的認(rèn)知功能障礙成明顯的正相關(guān)［1］，它的主要成分是過(guò)度磷酸化的tau蛋白。小檗堿（Berberine，Ber）又名黃連素，是從毛茛科植物黃連等干燥根莖中提取的一種苯并異喹啉類季銨型生物堿，已被廣泛用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等感染性疾病。近年來(lái)，有研究表明Ber對(duì)Aβ25－35誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用［2，3］；對(duì) H2O2和6－羥基多巴胺損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的抗氧化作用［4，5］。但到目前為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)Ber影響AD動(dòng)物模型或AD患者的相關(guān)研究尚少。因此，本研究利用岡田酸（Okadaic acid，OA）側(cè)腦室微量注射建立AD大鼠模型，探討B(tài)er對(duì)其額葉皮層磷酸化tau蛋白表達(dá)的影響。

材料和方法

1.材 料

1.1 動(dòng)物及分組

36只SD大鼠，雌雄各半，3-5月齡，體質(zhì)量（240±20）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（軍）2002-005，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組和Ber組，每組12只。

1.2 試劑及儀器

OA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Ber購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所（批號(hào)：1107132200218）；磷酸化Tau-Ser396和 Tau-Ser404單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。Morris水迷宮視頻系統(tǒng)為北京吉安得爾科技公司產(chǎn)品。

2.方 法

2.1 模型建立及給藥

將大鼠用10%水合氯醛（3.0ml／kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，參照Paxinos等［6］的大鼠腦立體定位圖譜，于前囟后0.8mm，中線右側(cè)旁開(kāi)1.3mm處用直徑1mm三棱鋼針鉆穿顱骨，抽得腦脊液后進(jìn)行側(cè)腦室微量注射，深度3.5mm，模型組大鼠緩慢注射OA（用10%DMSO溶解配制成0.4mmol／L）1.5μl，5min注射完畢，留針10min；隔3d同樣劑量再注射1次，共3次。對(duì)照組以同樣方法注入等體積10%DMSO。術(shù)后創(chuàng)面涂抹磺胺粉預(yù)防感染。Ber組于AD模型制作后1周開(kāi)始，每日給予Ber，按100mg／kg灌胃，共4周。對(duì)照組、模型組大鼠用同樣方法等容積生理鹽水灌胃。

2.2 行為學(xué)測(cè)試

各組大鼠于處死前6d進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試，以判定其學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。第1d將大鼠放入水池（不含平臺(tái)）自由泳2min，讓其熟悉水迷宮環(huán)境。之后每天分上、下午2個(gè)時(shí)間段，每段分別訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開(kāi)始時(shí)，將平臺(tái)置于SW象限，每個(gè)時(shí)間段分別從池壁4個(gè)起始點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池，記錄每次找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。如大鼠60s內(nèi)找不到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)，潛伏期為60s，每次間隔4min讓大鼠休息，再進(jìn)行下次實(shí)驗(yàn)。

2.3 灌注取材及免疫組化方法

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，從各組隨機(jī)取6只大鼠麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)升主動(dòng)脈相繼灌入生理鹽水150ml，4%多聚甲醛-0.1mol／L磷酸緩沖液（pH7.4）250ml，速度先快后慢，持續(xù)30min，取腦，石蠟包埋。采用SABC法對(duì)各組腦片進(jìn)行免疫組化染色，切片脫蠟至水后，用3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%BSA室溫孵育封閉25min；滴加pTau-Ser396／404一抗（1∶1 000），4℃過(guò)夜；滴加生物素結(jié)合的二抗（1∶100），37℃孵育30min；滴加 SABC孵育30min；DAB顯色約15min。用PBS代替一抗孵育作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。采用隨機(jī)方法，每組每種抗體分別取10張切片，在40倍物鏡下，取同一部位采集圖像，背景及曝光時(shí)間等條件均設(shè)一致，然后用圖像分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)定其OD值作為定量指標(biāo)。

2.4 Western blot方法

將各組其余大鼠頸椎脫臼處死，剝離額葉皮層組織，剪碎，加入10倍于其體積預(yù)冷的腦組織裂解液，靜置30min后，勻漿離心（4℃，13 000r／min，30min），取上清液，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。等量上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h；分別加入稀釋的pTau-Ser396／404一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2h；ECL化學(xué)發(fā)光顯色。以βactin作為內(nèi)參照。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用SPSS 11.5軟件單因素方差分析進(jìn)行組間比較。

結(jié) 果

1.行 為學(xué)測(cè)試結(jié)果

在Morris水迷宮測(cè)試中，各組大鼠平均逃避潛伏期日漸縮短。與對(duì)照組相比，AD模型組平均逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)（P＜0.01，P＜0.05）。Ber組與模型組比較，平均逃避潛伏期在第2d直到第6d均明顯縮短（P＜0.01，P＜0.05，Tab.1）。

2.各 組大鼠額葉皮層pTau-Ser396／404的表達(dá)

2.1 免疫組化結(jié)果

大鼠額葉皮層pTau-Ser396／404免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，高倍鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于神經(jīng)元胞漿和軸丘部位，胞核淡染。對(duì)照組可見(jiàn)少量的pTau-Ser396（Fig.1A）和pTau-Ser404（Fig.1D）陽(yáng)性神經(jīng)元，陽(yáng)性產(chǎn)物著色較淡；模型組額葉皮層的陽(yáng)性產(chǎn)物著色加深，其OD值均較對(duì)照組明顯增加（Fig.1B，E；Tab.2）。而B(niǎo)er組額葉皮層神經(jīng)元內(nèi)pTau-Ser396（Fig.1C）和 pTau-Ser404（Fig.1F）的表達(dá)量較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期的比較（ˉx±s，n＝12）Table 1 Average escape latency in each group（ˉx±s，n＝12）

圖1 各組大鼠額葉皮層pTau-Ser396（A-C）and pTau-Ser404（D-F）的表達(dá)。免疫組化染色。A，D 對(duì)照組；B，E 模型組；C，F(xiàn) Ber組。標(biāo)尺＝50μm.Fig.1Immunohistochemical staining showing the expression of pTau-Ser396（A-C）and pTau-Ser404（D-F）in the frontal cortex in control group（A，D），model group（B，E）and Ber group（C，F(xiàn)）.Bar＝50μm.

表2 各組大鼠額葉皮層pTau-Ser 396和pTau-Ser 404的表達(dá)（ˉx±s，n＝6）Table 2 Expression of pTau-Ser396and pTau-Ser404in frontal cortexin each group（ˉx±s，n＝6）

2.2 Western blot結(jié)果

各組大鼠額葉皮層神經(jīng)元pTau-Ser396／404免疫印跡結(jié)果見(jiàn)Fig.2，灰度值半定量分析可見(jiàn)，AD模型組額葉皮層pTau-Ser396／404的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）；Ber組額葉皮層pTau-Ser396／404的表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組大鼠額葉皮層pTau-Ser 396和pTau-Ser 404的表達(dá)（ˉx±s，n＝6）。免疫印跡法。1對(duì)照組；2模型組；3Ber組。Fig.2Expression of pTau-Ser396and pTau-Ser404was determined by western blotting in frontal cortex in the each group（ˉx±s，n＝6），1.Control；2.Model；3.Ber.

討 論

正常的tau蛋白是一種親水性、可溶性、非折疊的微管相關(guān)蛋白，主要分布于成熟神經(jīng)元的軸突，具有穩(wěn)定神經(jīng)元微管的作用，在維持神經(jīng)元生長(zhǎng)、保持神經(jīng)元極性及胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮重要作用。而過(guò)度磷酸化的tau蛋白則是不溶解的，扭曲變形的微管蛋白不能正常輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元末端的樹(shù)突和軸突發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良性萎縮。受累神經(jīng)元內(nèi)蛋白激酶／蛋白磷酸酯酶動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)是導(dǎo)致AD樣tau異常過(guò)度磷酸化的主要生化機(jī)制。蛋白磷酸酯酶2A（PP-2A）是主要的tau蛋白磷酸酯酶，OA是絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酯酶PP-2A與PP-1的特異性抑制劑。本研究采用側(cè)腦室多次微量注射OA，通過(guò)抑制PP-2A和PP-1的活性使激酶處于相對(duì)高活性狀態(tài)，從而能使tau蛋白過(guò)度磷酸化并形成NFTs樣改變。AD患者腦內(nèi)磷酸化的tau是正常老年人的4-5倍，tau的磷酸化位點(diǎn)很多，其中Ser396／404、Ser198／199／202等都是在 AD 中常見(jiàn)的被磷酸化位點(diǎn)［7］，在該實(shí)驗(yàn)中我們選取了Ser396／404位點(diǎn)作為磷酸化tau蛋白檢測(cè)指標(biāo)。免疫組化和 Western blot結(jié)果表明，模型組pTau-Ser396和pTau-Ser404蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高。Morris水迷宮測(cè)試表明AD模型組平均逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，這說(shuō)明用OA側(cè)腦室注射制作的AD模型已經(jīng)造成了大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力障礙，可以作為探討AD治療藥物的理想模型。

Ber（C20H17ONO5）是一種毒副作用小、具有廣泛用途的生物堿。有研究表明，Ber對(duì)H2O2、6-羥基多巴胺及Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷均具有明顯的保護(hù)作用［2－5］；能減少花萼海綿體誘癌素 A（calyculin-A）誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞tau蛋白磷酸化［8］。最近有報(bào)道，Ber可通過(guò)改變糖原合成酶-3β（GSK-3β）的活性來(lái)控制糖尿病小鼠的血糖水平［9］，而 GSK-3β是AD發(fā)病過(guò)程中起重要作用的一種蛋白激酶。但是，Ber對(duì)蛋白磷酸酯酶表達(dá)的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。該研究用Ber作用于OA致AD模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ber組大鼠額葉皮層內(nèi)pTau-Ser396和pTau-Ser404蛋白表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)到Ber可以顯著提高受損大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)了Ber能夠使AD模型大鼠皮層和海馬NFTs樣改變的數(shù)量明顯減少［10］。由此我們推測(cè)，Ber可能是通過(guò)激活蛋白磷酸酯酶（如PP-2A），從而對(duì)抗了OA對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，使蛋白磷酸激酶／磷酸酯酶比例又回歸平衡，tau蛋白的磷酸化水平趨于正常，才使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得以改善。

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