虞銘璐，夏鵬飛，尹靜波

(上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200444)

磷酸酯鍵在體內(nèi)參與核酸、三磷酸腺苷(ATP)、還原型輔酶I (NADH)和細(xì)胞膜磷脂雙分子層合成，是人體內(nèi)的一種重要化學(xué)鍵，合成機(jī)理包括磷酸或磷酰氯與醇的酯化反應(yīng)[1,2]。其中，磷酸與醇的酯化反應(yīng)活性較低，加入濃硫酸、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）[3]等催化劑可提高其反應(yīng)效率。磷酰氯與醇的酯化反應(yīng)活性高，是磷酸酯鍵的有效合成途徑。

Fig.1 列舉了磷酸酯鍵的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物可降解性和酶響應(yīng)性等性質(zhì)。磷酸酯鍵在體內(nèi)鍵合核苷酸合成核酸大分子時(shí)表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，保證了作為遺傳物質(zhì)的核酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[4]。磷酸酯鍵具有水解放熱的能力，在體內(nèi)參與ATP 形成，通過磷酸酯鍵斷裂釋能可實(shí)現(xiàn)ATP 為生命活動(dòng)供能的目的[5]。磷酸酯鍵具有一定的親水性，參與細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成，發(fā)揮控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的作用[6]。將磷酸酯鍵引入疏水性藥物可改善藥物的水溶性，提高疏水性藥物的細(xì)胞攝入效率。此外，磷酸酯鍵可提高疏水材料的親水性，有利于細(xì)胞黏附[7]。

Fig. 1 Properties of phosphate ester bond

Fig. 2 Esterification reaction of phosphoric acid and alcohols

值得一提的是，磷酸酯鍵具有酶響應(yīng)性，在堿性磷酸酶(ALP)催化作用下高效斷裂，成為一種新型的智能響應(yīng)“開關(guān)”[8]。研究者們將含磷酸酯鍵的聚合物制備成納米粒子[9]等材料，裝載藥物后用于細(xì)菌感染治療，磷酸酯鍵在細(xì)菌分泌的ALP 作用下斷裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌觸發(fā)的藥物控制釋放，達(dá)到良好的抗菌效果并提高藥物利用率。針對(duì)腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)的ALP[10]，可利用含磷酸酯鍵的聚合物膠束[11]等材料作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)化療藥物的靶向遞送，為腫瘤治療提供一種有效策略。

磷酸酯鍵還可用于調(diào)控材料的降解速率[12]，實(shí)現(xiàn)材料降解周期與組織生長(zhǎng)周期相匹配。水凝膠功能化的磷酸酯鍵被證實(shí)可以響應(yīng)成骨細(xì)胞分泌的ALP 而斷裂，實(shí)現(xiàn)水凝膠降解速率的調(diào)控，為新骨生長(zhǎng)提供充足的空間。此外，磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的磷酸根能促進(jìn)生物礦化[13]、促進(jìn)骨再生和骨整合[14]。

1 磷酸酯鍵合成機(jī)理

磷酸酯鍵的合成機(jī)理為磷酸或磷酰氯與醇的酯化反應(yīng)。

1）磷酸與醇的酯化反應(yīng)

Fig.2 是磷酸與醇的酯化反應(yīng)式，通過磷酸脫羥基及醇脫氫的反應(yīng)機(jī)理合成磷酸酯鍵[15]。該反應(yīng)活性較低，需要使用濃硫酸和BHT 等為催化劑。Brendan 等[3]以側(cè)鏈含有磷酸基團(tuán)的丙烯酸酯類聚合物為基礎(chǔ)，在BHT 催化作用下通過磷酸酯鍵成功鍵合了甲基丙烯酸縮水甘油酯。

2）磷酰氯與醇的酯化反應(yīng)

磷酰氯反應(yīng)活性高，是合成磷酸酯鍵的重要反應(yīng)物之一。1936 年，Arvin 首次發(fā)表了由雙酚A 與磷酸二酰氯?；s合得到聚磷酸酯的專利，證實(shí)了磷酰氯與醇發(fā)生酯化反應(yīng)合成磷酸酯鍵的可行性。Fig.3 是磷酰氯基團(tuán)與醇羥基的酯化反應(yīng)式，通過酰氯的醇解形成磷酸酯鍵。副產(chǎn)物鹽酸會(huì)降低反應(yīng)活性，加入堿作為縛酸劑可提高反應(yīng)效率。此外，通過三氯氧磷或磷酸二酰氯與多元醇酯化反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)鏈增長(zhǎng)獲得支化結(jié)構(gòu)[16]（Fig.4）。Yao等[11]通過磷酰氯與醇羥基的縮聚反應(yīng)獲得了含磷酸酯鍵的超支化聚磷酸酯。Du 等[17]以2-羥基乙基丙烯酸酯和二氯磷酸乙酯為原料，吡啶作為縛酸劑獲得了含有磷酸酯鍵的丙烯酸酯類化合物。

Fig. 3 Esterification reaction of phosphoryl chloride with alcohols

Fig. 4 Esterification reaction of phosphoryl chloride and polyhydric alcohols

Fig. 5 Application of phosphate ester bond-based intelligent response system in antibacterials

對(duì)比分析2 種合成機(jī)理，磷酰氯與醇的酯化反應(yīng)活性比磷酸與醇的反應(yīng)更高，且可以通過調(diào)節(jié)活性基團(tuán)比例設(shè)計(jì)不同的分子結(jié)構(gòu)，如支化結(jié)構(gòu)等，因而是合成磷酸酯鍵的有效策略。

2 磷酸酯鍵基智能響應(yīng)體系應(yīng)用

磷酸酯鍵由于具有智能響應(yīng)ALP 并快速斷裂的優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)、藥物控釋及生物探針等領(lǐng)域已獲得廣泛應(yīng)用，具有巨大研究?jī)r(jià)值。Tab.1 對(duì)磷酸酯鍵基智能響應(yīng)體系在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了匯總。

Tab. 1 Research progress of phosphate ester bond-based intelligent response system in biomedical field

2.1 用于細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞增殖和分化是細(xì)胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。含磷酸酯鍵的水凝膠可在細(xì)胞分泌的ALP 催化作用下降解，一方面為細(xì)胞擴(kuò)增提供空間，促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面降低水凝膠模量，促進(jìn)細(xì)胞黏附和分化[31]。

Gaihre 等[18]提出了一種通過水凝膠生物礦化促進(jìn)細(xì)胞分化的策略。由三氯氧磷和醇羥基的酯化反應(yīng)獲得含磷酸酯鍵的PEG 水凝膠，磷酸酯鍵在ALP 處理后斷裂并產(chǎn)生磷酸根，進(jìn)而結(jié)合鈣離子并生成羥基磷灰石，使水凝膠均勻礦化。此外，該P(yáng)EG 基生物礦化水凝膠能促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞黏附和增殖。

Wachiralarpphaithoon 等[19]通過開環(huán)聚合獲得了含磷酸酯鍵的丙烯酰氧基共聚物，并制備水凝膠。該水凝膠含有大量磷酸酯鍵，隨著水凝膠接種的細(xì)胞密度上升，水凝膠中的磷酸酯鍵在細(xì)胞分泌的ALP 的作用下斷裂并加速水凝膠降解，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要空間，達(dá)到了加速細(xì)胞增殖的效果。

Toda 等[20]通過自由基聚合法制備了含磷酸酯鍵的丙烯酰胺基水凝膠，磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，導(dǎo)致水凝膠的彈性模量下降，水凝膠上黏附的MSCs 骨架變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)狀，并有效上調(diào)了Runx2 等成骨基因的表達(dá)水平。

2.2 用于骨修復(fù)

含有磷酸酯鍵的生物材料一方面可調(diào)控材料的降解速率，為骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足空間，一方面可釋放利于基質(zhì)礦化的磷酸，因而在骨組織再生領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

Wang 等[12]合成了一種磷酸酯鍵基聚乙二醇(PhosPEG)水凝膠，用于包埋MSCs。該水凝膠中含有大量磷酸酯鍵，可在ALP 催化下加速裂解。在成骨培養(yǎng)基中，PhosPEG 水凝膠礦化程度顯著大于PEG 水凝膠。Watson 等[21]合成了側(cè)鏈含磷酸酯鍵的甲基丙烯酸酯類共聚物，在生理溫度下可熱引發(fā)交聯(lián)形成水凝膠。磷酸酯鍵在骨細(xì)胞產(chǎn)生的ALP 作用下斷裂，從而加速水凝膠局部降解，并提高了酶促降解區(qū)的細(xì)胞增殖和遷移。

將磷酸酯鍵整合到聚合物中，可模仿磷酸基團(tuán)在天然組織中的作用[22]，有利于鈣沉積，并促進(jìn)骨組織再生。Huang 等[22]制備了一種含有磷酸酯鍵的聚甘油葵二酸酯(PSeD-P)多孔支架，PSeD-P 中的磷酸酯鍵能夠模仿天然含磷分子結(jié)構(gòu)，并具有生物活性。另外，PSeD-P 支架上修飾的磷酸酯鍵還鍵合了骨誘導(dǎo)組分——β-甘油磷酸(β-GP)，其在降解過程中緩慢釋放，有利于干細(xì)胞的分化和礦化。

牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)是牙本質(zhì)基質(zhì)的重要組成部分，對(duì)骨礦化過程的羥基磷灰石沉積起至關(guān)重要的作用[32]，是骨和牙齒再生的主要候選材料。Gulseren 等[33]介紹了一種含有類似DPP 結(jié)構(gòu)的酶響應(yīng)性肽納米纖維體系，其中磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，使其自組裝形成凝膠。此外，磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的磷酸基團(tuán)能促進(jìn)磷灰石樣礦物沉積，促進(jìn)骨再生。該體系在設(shè)計(jì)新型復(fù)雜的骨科和牙科支撐材料中具有重要意義。

2.3 用于藥物控釋

酶響應(yīng)性藥物控釋體系能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在病灶區(qū)的按需釋放，并避免藥物突釋引起的副作用，在臨床具有極高的應(yīng)用價(jià)值。磷酸酯鍵可以響應(yīng)細(xì)菌感染或癌癥環(huán)境下高表達(dá)的ALP 并發(fā)生斷裂，從而可作為一種智能響應(yīng)體系“開關(guān)”，在藥物控釋領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

Xiong 等[23]報(bào)道了一種含磷酸酯鍵的具有核殼結(jié)構(gòu)的納米凝膠(Fig.5(A))，該納米凝膠在甘露糖靶向指引下可進(jìn)入巨噬細(xì)胞，磷酸酯鍵在細(xì)菌分泌的ALP 作用下斷裂，觸發(fā)納米凝膠內(nèi)核裂解，實(shí)現(xiàn)萬(wàn)古霉素控制釋放(Fig.5(B))，有效抑制了耐甲氧西林葡萄球菌的生長(zhǎng)。進(jìn)一步地，Chen 等[24]在含磷酸酯鍵和抗生素—環(huán)丙沙星(CIP)的納米粒子上功能化了具有細(xì)菌識(shí)別能力的去鐵胺(DFO)，磷酸酯鍵在響應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)ALP 后斷裂并觸發(fā)去鐵胺-環(huán)丙沙星復(fù)合物釋放，達(dá)到了高效殺菌的目的(Fig.5(C,D))。

Fig. 6 Schematic illustration of preparation and application of chitosan-based membranes[25]

Fig. 7 Illustration of structure of DOX- and IR-780 coloaded hyperbranched polyphosphoester nanomedicines[11]

牙周炎是一種細(xì)菌誘導(dǎo)的慢性、破壞性的炎癥性疾病，會(huì)損傷牙周組織，最終導(dǎo)致牙齒脫落[34,35]。牙周炎發(fā)作時(shí)，牙周組織中ALP 含量異常升高[36,37]。針對(duì)這一特性，Li 等[25]制備了一種含磷酸酯鍵且負(fù)載有抗生素—鹽酸米諾環(huán)素的殼聚糖膜(Fig.6)。該載藥薄膜具有ALP 響應(yīng)性，一方面可控釋鹽酸米諾環(huán)素，達(dá)到牙周炎治療目的；另一方面可加快殼聚糖膜降解，為牙周炎下的牙槽骨組織缺損修復(fù)提供了一種有效策略。

此外，腫瘤環(huán)境下也存在ALP 的過度表達(dá)，因此，含磷酸酯鍵的藥物控釋材料在腫瘤治療領(lǐng)域也具有應(yīng)用價(jià)值。Yao 等[11]合成了可降解超支化聚磷酸酯(hPPE)，并用相分離法制備成膠束，用于抗癌藥——阿霉素的遞送[Fig.7]。hPPE 中的磷酸酯鍵受ALP 作用斷裂，進(jìn)而引發(fā)了納米膠束的裂解和阿霉素的釋放。Wu 等[26]設(shè)計(jì)了一種含磷酸化酪氨酸的酶響應(yīng)自組裝分子(LND-p-ES)。通過ALP 催化斷裂磷酸酯鍵實(shí)現(xiàn)LND-p-ES 自組裝形成納米纖維，提高了癌細(xì)胞攝取納米纖維的效率，從而達(dá)到將化療藥—洛尼達(dá)明（LND）靶向送達(dá)癌細(xì)胞的目的。為了延長(zhǎng)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的停留時(shí)間，Hong 等[38]設(shè)計(jì)了一種含磷酸酯鍵的自組裝兩親性肽藥物遞送系統(tǒng)。兩親性肽在負(fù)載疏水性化療藥——DOX 后組裝成球形載藥納米顆粒，磷酸酯鍵在ALP 的作用下斷裂，使多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變并形成納米纖維，從而有效釋放包裹DOX。該方法提高了腫瘤部位的局部藥物積累，在抗腫瘤治療中的具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.4 用于生物探針

生物探針是分子生物學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中用于指示特定物質(zhì)的性質(zhì)或物理狀態(tài)的一類標(biāo)記分子，具有傳感、熒光成像等功能[39]。生物探針上修飾的磷酸酯鍵可在ALP 作用下斷裂，引起探針分子親疏水性或構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而具備熒光標(biāo)記特性[40]，因而在ALP 高表達(dá)的病灶區(qū)具有應(yīng)用價(jià)值。

腫瘤環(huán)境下ALP 含量異常增高，因而含磷酸酯鍵的生物探針在腫瘤診斷領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。Ye等[27]在疏水性多肽上連接了含磷酸酯鍵的近紅外(NIR)熒光團(tuán)P-Cy 和順磁螯合物DOTA-Gd，得到含磷酸酯鍵的多肽探針P-CyFF-Gd。磷酸酯鍵在ALP作用下斷裂并觸發(fā)多肽探針原位自組裝并觸發(fā)熒光反應(yīng)(Fig.8(A))。該探針具有無(wú)創(chuàng)、高靈敏度、高分辨率成像等優(yōu)勢(shì)，NIR 引導(dǎo)下可實(shí)現(xiàn)肝腫瘤的實(shí)時(shí)標(biāo)記。Gao 等[28]合成了由七甲氰熒光團(tuán)和磷酸單酯構(gòu)成的NIR 探針QcyP(Fig.8(B))。在ALP 作用下，磷酸酯鍵斷裂，導(dǎo)致共軛π-電子體系的重排，觸發(fā)了探針的“開關(guān)”，可以精準(zhǔn)識(shí)別肝腫瘤細(xì)胞。Zhong 等[41]報(bào)道了一種含有發(fā)光基團(tuán)——香豆素和磷酸酯鍵的多肽衍生物(pYD)(Fig.8(C))。pYD 的磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂，并原位自組裝形成發(fā)光納米纖維，實(shí)現(xiàn)腫瘤顯影。Li 等[42]合成了含有磷酸酯鍵的喹啉-丙二腈基納米探針(DQM-ALP)。探針的磷酸酯鍵在ALP 的作用下斷裂，疏水內(nèi)核聚集誘導(dǎo)熒光反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)ALP 的高分辨率顯影。

Fig. 8 Application of phosphate ester bond-based intelligent response system intumor tracer

此外，由于各種磷酸酯衍生物對(duì)骨礦物質(zhì)和鈣鹽具有高親和力，已被廣泛用作骨成像和骨病治療的靶向治療劑[43]。在骨組織修復(fù)初期，新骨形成情況難以通過計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像顯示[44]，因此高分辨率實(shí)時(shí)活體成像技術(shù)成為新骨生長(zhǎng)發(fā)育的重要探測(cè)手段。ALP 在新生骨組織中含量較高，可作為一種骨形成的早期生物標(biāo)志物。Park 等[29]合成了包含酚類二羥基噻吩熒光基團(tuán)和磺酸基磷酸鹽的NIR 探針。磷酸酯鍵在ALP 作用下斷裂后可發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)ALP 響應(yīng)性的熒光開啟(Fig.9(A))。將這種探針標(biāo)記在磷酸鈣支架上，可以監(jiān)測(cè)支架植入后早期ALP 的表達(dá)，從而評(píng)估支架內(nèi)骨礦物沉積情況。Yang 等[30]構(gòu)建了一種聚己內(nèi)酯/硅酸鈣復(fù)合支架，半胱氨酸(LET-3)在支架表面通過自組裝技術(shù)形成納米粒子, 用于ALP 水平監(jiān)測(cè)和成像(Fig.9(B))。其中LET-3 中含有磷酸酯鍵，能夠被ALP 特異性斷裂，激活其NIR 成像特性。將含有磷酸酯鍵的生物探針與骨組織工程支架結(jié)合是檢測(cè)新骨形成的一種很有前景的策略，在組織修復(fù)體內(nèi)示蹤領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

Fig. 9 Application of phosphate ester bond based intelligent response system in bone detection

3 總結(jié)與展望

磷酸酯鍵具有高度穩(wěn)定性、親水性、酶響應(yīng)性、促進(jìn)生物礦化等性能，因而備受研究者矚目。在細(xì)胞培養(yǎng)中，通過磷酸酯鍵的智能響應(yīng)性斷裂可實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用；在骨修復(fù)領(lǐng)域，磷酸酯鍵的智能響應(yīng)性可使材料降解周期與骨生長(zhǎng)周期相匹配，同時(shí)促進(jìn)礦化，加速骨缺損修復(fù)；基于磷酸酯鍵的智能響應(yīng)藥物控釋系統(tǒng)可作為抗生素和抗癌藥載體，實(shí)現(xiàn)靶向釋放；基于磷酸酯鍵的智能響應(yīng)體系還可作為生物探針實(shí)現(xiàn)高分辨率腫瘤成像及新骨生成檢測(cè)。

未來, 如何通過分子結(jié)構(gòu)及材料組成設(shè)計(jì)，提高磷酸酯鍵特異性響應(yīng)ALP 的靈敏度，并拓寬磷酸酯鍵基智能響應(yīng)體系的應(yīng)用領(lǐng)域是研究者們的目標(biāo)。