曾榮華 李菁

（1中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣東廣州，510240；2廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司）

HPLC法測(cè)定靈芝孢子油中甘油三油酸酯含量

曾榮華1，2李菁1，2

（1中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣東廣州，510240；2廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司）

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定靈芝孢子油中甘油三油酸酯含量的方法。方法：色譜柱為Kromasil 100-5C18，流動(dòng)相為乙腈-異丙醇（53∶47），流速為1.0m L/m in，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：甘油三油酸酯在2.290~13.740μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 6，平均回收率為99.10%，RSD為1.65%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可行、重復(fù)性好，可作為靈芝孢子油及其制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法之一。

靈芝孢子油；甘油三油酸酯；高效液相色譜法

靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)極其細(xì)小的孢子，為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，能夠滋養(yǎng)強(qiáng)壯、扶正固本、補(bǔ)益精氣、寧心安神、健脾和胃。靈芝孢子油是由靈芝孢子粉經(jīng)CO2超臨界萃取而得的脂溶性物質(zhì)，主要以甘油三酯形式存在，還含有少量游離脂肪酸和類(lèi)固醇酯[1]。功效研究表明具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫、護(hù)肝等功能[2-5]。本研究在前期對(duì)靈芝孢子油中甘油三酯類(lèi)成分的分離與鑒定研究的基礎(chǔ)上，建立了靈芝孢子油中甘油三油酸酯的含量測(cè)定方法，為靈芝孢子油及其制劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效方法和檢驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型液相色譜儀及工作站，配備Sedere Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

1.2 試藥

甘油三油酸酯對(duì)照品（Sigma公司，批號(hào)：119K1373），供含量測(cè)定用；靈芝孢子油，廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司提供；乙腈、異丙醇為色譜純，其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil 100-5C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相:乙腈 - 異丙醇（53∶47）；流速：1.0 m L/m in。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)：溫度60℃，氮?dú)鈮毫?350 kPa。

2.2 供試品溶液的制備

取靈芝孢子油約100mg，精密稱(chēng)定，置25 m L量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取甘油三油酸酯對(duì)照品 4.58 mg，置10 m L量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

分別取對(duì)照品溶液5μL，供試品溶液 10μL注入色譜儀，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1、2），結(jié)果甘油三油酸酯與樣品中其他成分峰能較好分離。

圖1 甘油三油酸酯對(duì)照品HPLC圖

圖2 靈芝孢子油HPLC圖

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

取2.3項(xiàng)下甘油三油酸酯對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 5、10、15、20、30μL，記錄峰面積，取峰面積的對(duì)數(shù)（Y）及進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：Y=1.720 8 X+5.036 1，r＝ 0.999 6，結(jié)果顯示，甘油三油酸酯在2.290~13.740μg范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)中的條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD=1.21%，表明進(jìn)樣精密度符合規(guī)定。

另取同批樣品，按2.2項(xiàng)下操作，以2.1項(xiàng)中的條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果峰面積RSD=1.32%，表明進(jìn)樣精密度符合規(guī)定。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同批樣品，按2.2項(xiàng)下處理后，以2.1項(xiàng)中的條件每隔一定時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定一次，進(jìn)樣時(shí)間分別為 0、5、10、17、24 h，每次進(jìn)樣 10μL，記錄峰面積。結(jié)果峰面積 RSD=1.89%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批樣品6份，各約100mg，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下操作，以2.1項(xiàng)中的條件測(cè)定，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，進(jìn)樣量10μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算甘油三油酸酯含量，結(jié)果RSD=1.62%，表明方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同批樣品6份，各約50mg，精密稱(chēng)定，置25m L量瓶中，加入甘油三油酸酯對(duì)照品溶液（7.950mg/m L）各1m L，用流動(dòng)相稀釋至刻度，以2.1項(xiàng)中的條件測(cè)定，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，進(jìn)樣量10μL，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算甘油三油酸酯的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 含量測(cè)定

取10批樣品，按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，每批樣品平行制備2份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，色譜條件如2.1項(xiàng)下所示。記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算甘油三油酸酯的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)

3 討論

3.1 目前控制靈芝孢子油的質(zhì)量主要采用紫外光譜法測(cè)定靈芝孢子油中的總?cè)坪浚罅康奈墨I(xiàn)報(bào)道靈芝子實(shí)體中含有三萜類(lèi)成分，而在靈芝孢子粉中較少報(bào)道三萜類(lèi)成分，因此測(cè)定靈芝孢子粉或靈芝孢子油中三萜類(lèi)成分的專(zhuān)屬性不強(qiáng)，用來(lái)評(píng)價(jià)孢子粉及孢子油的質(zhì)量有一定的局限性。鑒于前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道靈芝孢子油主要含有甘油三酯類(lèi)組分，本研究采用HPLC測(cè)定靈芝孢子油中的甘油三油酸酯含量，作為控制靈芝孢子油質(zhì)量的有效方法之一，該方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，特有性強(qiáng)。

表2 10批靈芝孢子油測(cè)定結(jié)果

3.2 靈芝孢子油中主要含有甘油三酯類(lèi)成分，而甘油三酯類(lèi)成分無(wú)紫外吸收，且不易揮發(fā)，因此適宜采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)研究，在漂移管溫度為60℃，氮?dú)鈮毫?50 kPa時(shí)信號(hào)響應(yīng)較佳。此外，對(duì)流動(dòng)相的比例，流速，柱溫等液相條件進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈：異丙醇（53∶47），流速為 1.0 m L/m in，其出峰時(shí)間、分離度等都較佳，達(dá)到了含量測(cè)定的要求。

[1]王杉，周科勤，范青生，等.超臨界CO2萃取菌草靈芝孢子油中三萜類(lèi)物質(zhì)和脂肪酸的測(cè)定[J].食品安全與檢測(cè)，2006，22（1）：74-76.

[2]梁堅(jiān)，楊俊峰，何為濤，等.靈芝孢子油軟膠囊對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（6）： 1189-1191.

[3]李森柱，謝意珍，周靜文，等.靈芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究[J].中國(guó)食用菌，2006，25（5）：40-42.

[4]黃健康，王鳳巖，黃瓊，等.靈芝孢子油增強(qiáng)小鼠免疫功能及護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（7）：1272-1274.

[5]Xie Yi-Zhen，Li Sen-Zhu，Albert Yee，et al.Canoderma lucidum inhibits tumour cellproliferation and induces tumour celldeath[J].Enzyme and M icrobial Technology， 2006，40（1）：177-185.

Content Determination of Glycerol Trioleate in Ganoderma lucidum Spore Oilby HPLC

Zeng Ronghua1，2， Li Jing1，2（1 National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM，Guangdong Guangzhou 510240，China；2 Guangzhou Hanfang Natural Medicine R&D Co.，Ltd.）

Objective:To establish the method for determining the content of glycerol trioleate in Ganoderma lucidum spore oil（GLSO）by HPLC.M ethods:Kromasil C18analytical column was used with acetonitrile-isopropanol（53∶47） as the mobile phase.The flow rate was 1.0 m L/min and evaporative light-scattering detector was used.Results： A good linear was obtained in the range of 2.290~13.740μg for glycerol trioleate（r=0.999 6）.The average recovery was 99.10%（RSD=1.65%）.Conclusion： Themethod is simple and accurate with a good reproducibility and can be applied to the quality control of GLSO.

Ganoderma Lucidum Spore Oil；Glycerol Trioleate；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.08.005

廣州市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目——靈芝孢子油靜脈注射乳劑的研究與開(kāi)發(fā)（2006Z2-E5081）

曾榮華，女，研究員。研究方向：中藥研發(fā)。E-mail:xiaohua305@163.com

2012-01-18）