汪匯慧，金虎，高敏杰，戴科科，董世娟，于瑞嵩，李震，史仲平

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所，上海 201106

豬α干擾素 (Porcine interferon α，pIFN-α)是一種重要的抗口蹄疫、抗豬生殖和呼吸綜合癥的獸藥，具有非常廣闊的應(yīng)用前景[1]。合作單位上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所成功地在畢赤酵母中克隆表達(dá)了pIFN-α，搖瓶條件下的最高抗病毒活性達(dá)到2.1×104IU/mL[2]。畢赤酵母生產(chǎn)表達(dá)外源蛋白是高耗氧高耗能的過程，探討研究罐規(guī)模下畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn) pIFN-α過程的能量代謝規(guī)律及其對發(fā)酵性能的影響，可為構(gòu)建高效和批量化的 pIFN-α發(fā)酵生產(chǎn)體系、以及pIFN-α的商業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒和參考。

畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)生產(chǎn)表達(dá)外源蛋白過程一般由前期細(xì)胞培養(yǎng)和后期誘導(dǎo)表達(dá)兩個(gè)階段構(gòu)成。在獲取了大量、具有蛋白分泌表達(dá)功能的細(xì)胞以后，誘導(dǎo)階段通過合理的甲醇誘導(dǎo)來提高單位體積培養(yǎng)液中的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平(活性、效價(jià)等)，這是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、商業(yè)化藥物蛋白生產(chǎn)的另一個(gè)最關(guān)鍵因素。外源蛋白的高效誘導(dǎo)至少與大量獲取功能性生物體同等重要、甚至更加重要。畢赤酵母誘導(dǎo)外源蛋白一般在30 ℃下進(jìn)行。這時(shí)，甲醇充當(dāng)了碳源、能源和誘導(dǎo)劑三重角色，因此，誘導(dǎo)階段的代謝過程以及相應(yīng)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的控制也更為復(fù)雜。國內(nèi)外有關(guān)誘導(dǎo)階段重組畢赤酵母發(fā)酵控制的研究報(bào)道主要集中在甲醇濃度和pH的最適控制水平[3-4]、低溫誘導(dǎo)的作用[5-6]以及非限制性碳源與甲醇共混流加進(jìn)行誘導(dǎo)[7]等幾個(gè)方面。其中，低溫誘導(dǎo)和山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)的公認(rèn)作用就是抑制蛋白酶的分泌、減少目標(biāo)蛋白的降解、緩解細(xì)胞衰亡[8]。畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源表達(dá)外源蛋白時(shí)，一般認(rèn)為通過甲醛異化途徑為提供功能性細(xì)胞和目標(biāo)蛋白的合成提供能量[9-10]，該途徑在為蛋白合成提供能量的同時(shí)，中間代謝產(chǎn)物甲醛等脫離過氧化物酶體(Peroxisome) 進(jìn)入到液胞內(nèi)，會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[11]，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的濃度或活性低、高效表達(dá)難以長時(shí)間地持續(xù)下去。我們前期的研究結(jié)果[12-14]表明，低溫 (20 ℃) 誘導(dǎo)可以改變甲醇代謝中的代謝流分布、加大蛋白合成支路的碳代謝通量、提高能量 (ATP) 再生效率和目標(biāo)蛋白的濃度。但是，由于此時(shí)ATP的供給需求大幅增加、耗氧量激增，導(dǎo)致規(guī)模發(fā)酵 (10~100 L) 下的操作成本 (冷卻和供氧能耗) 急劇上升。山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)可緩解甲醇作為唯一能源對細(xì)胞工作運(yùn)轉(zhuǎn)的供能壓力和目標(biāo)蛋白的降解，同時(shí)還對醇氧化酶AOX具有一定程度的可逆性抑制作用[7]、可以對甲醇代謝速率進(jìn)行適度調(diào)控。理論上，這可以緩解低溫誘導(dǎo)條件下 O2需求過高、溫度和溶解氧濃度 (DO) 難以控制的問題。本研究以提高豬α干擾素抗病毒活性、降低發(fā)酵成本為目標(biāo)，重點(diǎn)探討了10 L罐下，山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)對畢赤酵母生產(chǎn)豬α干擾素產(chǎn)能途徑改變和發(fā)酵性能改善的影響，為豬α干擾素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌種

重組巴斯德畢赤酵母 Pichia psatoris KM71H (IFNα-pPICZαA) 菌株，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

平板活化培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，瓊脂20，pH自然。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母抽提物10，pH自然。

10 L罐初始培養(yǎng)基、甘油流加以及甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (g/L)：參見參考文獻(xiàn)[12]。

山梨醇流加培養(yǎng)基 (g/L)：山梨醇500。

1.3 分析方法

1.3.1 細(xì)胞濃度、甲醇濃度和 pIFN-α抗病毒活性測定

方法參見文獻(xiàn)[12]。

1.3.2 發(fā)酵液中山梨醇濃度和胞內(nèi)甲醛、甲酸含量測定

采用高效液相色譜法測定。測定胞內(nèi)甲醛、甲酸時(shí)，首先按Suye等[15]所報(bào)道的方法進(jìn)行細(xì)胞破壁、離心后得到上清。粗樣品均先用0.22 μm的PVDF膜進(jìn)行過濾處理。山梨醇測定條件是，柱型號(hào)：Aglient氨基柱；檢測器：示差折光檢測器 (RID)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相組成：乙腈/超純水=7∶3 (V/V)；流動(dòng)相流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。甲醛和甲酸測定條件是，柱型號(hào)：Agilent ZORBAX SB C18柱；檢測器：紫外檢測器 (UV)，檢測波長254 nm；流動(dòng)相組成：20 mmol/L Na2PO4溶液/乙腈=99∶1；柱溫：28 ℃，流動(dòng)相流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 mL。

1.3.3 醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶活性測定

AOX酶活性按Suye等[15]所報(bào)道的方法進(jìn)行測定。甲醛脫氫酶 (FDH) 和甲酸脫氫酶 (FLD)活性按文獻(xiàn)[16]所報(bào)道方法進(jìn)行測定。

1.3.4 異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶活性測定

異檸檬酸脫氫酶 (Isocitrate dehydrogenase，IDH) 和 α-酮戊二酸脫氫酶活性 (α-ketoglutarte dehydrogenase，α-KGDHC) 分別按文獻(xiàn)[17-18]所報(bào)道的方法進(jìn)行測定。

1.4 發(fā)酵罐條件下的流加培養(yǎng)和誘導(dǎo)方法

畢赤酵母流加培養(yǎng)過程在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，初始裝液量為5 L。30 ℃ (常溫) 和20 ℃ (低溫) 下的甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)操作條件和底物/誘導(dǎo)劑流加控制方法同文獻(xiàn)[12]。根據(jù)前期優(yōu)化結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)期的甲醇濃度均控制在10 g/L。甲醇/山梨醇共混流加方法：細(xì)胞濃度達(dá)到 120~130 g DCW/L后甘油流加培養(yǎng)結(jié)束(30~32 h)，饑餓培養(yǎng)約30 min耗盡殘留甘油，30 ℃下同時(shí)添加甲醇和山梨醇培養(yǎng)基。通過甲醇在線測量和控制裝置將甲醇濃度控制在10 g/L左右，使用蠕動(dòng)泵以不同的設(shè)定轉(zhuǎn)速恒速流加山梨醇，控制其殘留濃度低于0.5 g/L。利用電子天平在線記錄甲醇和山梨醇流加瓶的質(zhì)量損失，并通過A/D-D/A多通道數(shù)據(jù)采集卡將數(shù)據(jù)傳遞給工控機(jī)，據(jù)此計(jì)算甲醇和山梨醇的實(shí)際添加量，以及甲醇和山梨醇平均消耗 (代謝) 速率。利用尾氣分析儀測定發(fā)酵尾氣中的O2和CO2分壓，并借助RS232通信接口將數(shù)據(jù)記錄于工控機(jī)中，按公式[19]計(jì)算耗氧速率OUR和CO2釋放速率CER。

1.5 儀器設(shè)備生產(chǎn)廠家及型號(hào)

10 L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司產(chǎn)，GUJS-10；甲醇在線測量和控制裝置：上海蘇泊公司產(chǎn)，F(xiàn)C2002；蠕動(dòng)泵：保定蘭格公司產(chǎn)，BT00-50M；電子天平：上海海康公司產(chǎn)，JA1102；尾氣分析儀：韓國LOKAS公司產(chǎn)，LKM2000A；A/D-D/A多通道數(shù)據(jù)采集卡：臺(tái)灣研華公司產(chǎn)，PCL-812PG。

2 結(jié)果與分析

2.1 30 ℃/20 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和 30 ℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 pIFN-α發(fā)酵生產(chǎn)性能

前期研究結(jié)果表明，控制誘導(dǎo)階段的甲醇濃度在10 g/L左右是實(shí)現(xiàn)pIFN-α高效表達(dá)的前提條件[14]。在該最優(yōu)甲醇濃度 (10 g/L) 下，比較了30 ℃ (常溫)/20 ℃ (低溫) 甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和30 ℃甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)條件對 pIFN-α發(fā)酵生產(chǎn)性能 (抗病毒活性、總蛋白) 的影響。圖1的結(jié)果表明，降低誘導(dǎo)溫度 (30 ℃→20 ℃)和采用甲醇/山梨醇共混流加策略 (30 ℃) 都能提高 pIFN-α的表達(dá)水平，但甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)對總蛋白濃度和 pIFN-α抗病毒活性水平的提高幅度更為顯著。低溫20 ℃誘導(dǎo)下的最高pIFN-α抗病毒活性達(dá)1.4×106IU/mL，是傳統(tǒng) 30 ℃誘導(dǎo)下最高 pIFN-α抗病毒活性(1.35×105IU/mL) 的近10倍 (圖1B)。而采用甲醇/山梨醇共混流加策略，兩種山梨醇流加速率下的最高pIFN-α抗病毒活性都在1×106IU/mL以上。特別是較低山梨醇流加速率0.785 g/(L·h) 下的最高抗病毒活性更是達(dá)到 1.8×107IU/mL，是傳統(tǒng)30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下最高pIFN-α抗病毒活性的近100倍 (圖1B)。甲醇/山梨醇共混流加條件下，總蛋白濃度在整個(gè)誘導(dǎo)期持續(xù)增長 (圖1A)，說明該條件提高了細(xì)胞合成蛋白的能力、特別是提高了表達(dá)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的能力。

圖1 不同誘導(dǎo)條件下的總蛋白濃度和pIFN-α抗病毒活性變化曲線Fig. 1 Total protein concentrations and pIFN-α antiviral activities under different induction strategies. Open symbols: pure methanol induction at 30 °C (○) and 20 °C (△); filled symbols: methanol/sorbitol co-feeding at 30 °C with sorbitol feeding rate of 0.785 g/(L·h) (●) and 1.437 g/(L·h) (■), respectively.

2.2 不同誘導(dǎo)條件對甲醇代謝關(guān)鍵酶 AOX、FLD和FDH活性的影響

醇氧化酶 (AOX) 是催化甲醇代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶，AOX活性的高低直接決定了甲醇的代謝速率，并間接影響到 pIFN-α的發(fā)酵生產(chǎn)水平。由于不同誘導(dǎo)策略下，進(jìn)入到誘導(dǎo)期后的細(xì)胞濃度基本相同 (120~130 g DCW/L)，圖2中的AOX比活性實(shí)際體現(xiàn)了不同誘導(dǎo)條件下細(xì)胞代謝甲醇的能力。與30 ℃常溫誘導(dǎo)相比，20 ℃低溫誘導(dǎo)條件下的AOX比活性最高，是常溫30 ℃誘導(dǎo)下相應(yīng)活性的4~5倍。低溫誘導(dǎo)條件下，甲醇代謝 (消耗) 速率明顯加快 (表 1)，甲醇代謝主路 (甲醇→甲醛) 的總代謝碳流大大增加。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的甲醇代謝主要依賴兩條途徑：甲醛異化產(chǎn)能途徑和目標(biāo)蛋白合成途徑。其中產(chǎn)能途徑在釋放大量CO2的同時(shí)產(chǎn)生輔酶NADH，而 NADH又要通過耗氧的氧化磷酸化反應(yīng)生成ATP，為功能性細(xì)胞的代謝和目標(biāo)蛋白的合成提供能量。因此，低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下的高甲醇消耗導(dǎo)致了發(fā)酵過程極高的耗氧需求，其結(jié)果是該條件下的溶解氧DO控制不住，一直在極低水平下徘徊 (表1)。30 ℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的AOX比活性與30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的水平基本相當(dāng)，沒有提高，但是，此條件下的pIFN-α抗病毒活性卻提高了近百倍，表明該誘導(dǎo)條件下的碳代謝特別是能量供應(yīng)途徑可能發(fā)生了改變。另外，與文獻(xiàn)報(bào)道[20]不同，本研究使用的KM71型畢赤酵母屬于甲醇利用慢型菌，AOX活性在誘導(dǎo)15~30 h后甚至更長時(shí)間才能達(dá)到最大。其原因在于，該菌AOX1啟動(dòng)子的缺失使其代謝甲醇的能力下降、對甲醇誘導(dǎo)環(huán)境的適應(yīng)時(shí)間更長；高濃度甲醇環(huán)境下，細(xì)胞易產(chǎn)生“甲醇中毒”現(xiàn)象，故在誘導(dǎo)初期采用逐級提升的方式使甲醇濃度緩慢地接近其控制水平。

圖2 不同誘導(dǎo)條件對AOX活性的影響Fig. 2 Time course of specific AOX activities under different induction strategies. Open symbols: pure methanol induction at 30 °C (○) and 20 °C (△); filled symbols: methanol/sorbitol co-feeding at 30 °C with sorbitol feeding rate of 0.785 g/(L·h) (●) and 1.437 g/(L·h) (■), respectively.

表1 甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)時(shí)畢赤酵母的碳和能量代謝以及發(fā)酵性能的比較Table 1 Comparison of carbon and energy metabolism, as well as fermentation performance under different induction strategies

為了驗(yàn)證上述能量供應(yīng)途徑發(fā)生改變的推測，對不同誘導(dǎo)條件下的甲醛異化產(chǎn)能途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，甲醛脫氫酶 (FLD) 和甲酸脫氫酶(FDH) 的比活性進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。以常溫30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)的數(shù)據(jù)作為基準(zhǔn)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，低溫20 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的FLD和FDH最高，幾乎達(dá)到基準(zhǔn)值10倍左右的水平，表明此條件下甲醛異化產(chǎn)能途徑的代謝極其活躍。但是，與基準(zhǔn)值相比，30 ℃甲醇/山梨醇共混流加下的 FLD和 FDH的比活性不但沒有提高，反而有所降低，尤其是FLD的活性非常低，幾乎接近于0 (圖3A)。由于甲醛異化產(chǎn)能途徑中的化學(xué)反應(yīng)是連續(xù)序列式的反應(yīng)，共混流加下很低的FLD活性水平表明，甲醇/山梨醇共混流加條件下，甲醛異化產(chǎn)能途徑的代謝活性明顯弱化，無法為pIFN-α蛋白的合成提供足夠的能量。但是，此條件下的發(fā)酵液總蛋白濃度和 pIFN-α蛋白抗病毒活性反而更高 (圖1)，該事實(shí)進(jìn)一步顯示甲醇/山梨醇共混流加條件下的細(xì)胞供能途徑確實(shí)發(fā)生了改變。

2.3 甲醇/山梨醇共混流加改變 pIFN-α發(fā)酵生產(chǎn)的供能途徑

TCA循環(huán)是許多耗氧微生物生長以及代謝產(chǎn)物合成過程的主要供能途徑，畢赤酵母在利用甘油增殖生長時(shí)，其能量供應(yīng)也來自于 TCA循環(huán)。進(jìn)入到誘導(dǎo)期時(shí)，畢赤酵母以甲醇為唯一碳源表達(dá)外源蛋白，一般公認(rèn)甲醛異化途徑是唯一的供能途徑[9-10]，但也有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為有一部分ATP和NADH來自于TCA循環(huán)[21-22]。在甲醇/山梨醇共混流加條件下，由于兩種碳源、山梨醇和甲醇可以同時(shí)被利用，因此可能存在其他的供能途徑，為細(xì)胞合成目標(biāo)蛋白提供能量，但目前尚無相關(guān)的研究報(bào)道。為考證甲醇/山梨醇共混流加條件下可能出現(xiàn)的供能途徑改變，對pIFN-α誘導(dǎo)階段 TCA循環(huán)中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，α-酮戊二酸脫氫酶 (α-KGDHC) 和異檸檬酸脫氫酶(IDH) 的活性水平進(jìn)行了分析測試。

圖4的結(jié)果表明，甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí) (30 ℃/ 20 ℃)，這兩個(gè)酶的活性均處于較低水平，特別是異檸檬酸脫氫酶 (IDH) 活性的實(shí)測值在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)均接近于零。由于 TCA循環(huán)途徑也是連續(xù)序列式反應(yīng)，以NAD+為輔因子的限速酶IDH的活性大小直接決定了整個(gè) TCA循環(huán)的代謝活性和通量。極低的IDH活性表明甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下TCA循環(huán)被弱化甚至關(guān)閉，能量物質(zhì)NADH無法生成，進(jìn)而為 pIFN-α蛋白的合成提供能量(ATP)。上述結(jié)果也支持了甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)情況下，TCA循環(huán)不是供能途徑的文獻(xiàn)結(jié)論[9-10]。但是，在甲醇/山梨醇共混流加條件下，上述兩個(gè)酶的活性均明顯高于甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的活性水平，其中尤以IDH酶活性的提高最為明顯。其原因可能是共混加入的輔助碳源-山梨醇可轉(zhuǎn)化為 6-磷酸果糖而直接進(jìn)入糖酵解途徑，然后再繼續(xù)進(jìn)入到TCA循環(huán)，產(chǎn)生供能物質(zhì)NADH。甲醇/山梨醇共混流加條件下IDE和α-KGDHC活性的大幅提高直接驗(yàn)證了細(xì)胞供能途徑發(fā)生改變的推測。

2.4 甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)時(shí)畢赤酵母的碳和能量代謝以及發(fā)酵性能的比較分析

圖5是不同誘導(dǎo)條件下，畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)pIFN-α?xí)r的碳和能量代謝的示意圖。當(dāng)甲醇作為唯一碳源/能源誘導(dǎo)生產(chǎn)pIFN-α?xí)r，甲醇在圖5所示的細(xì)胞同化 (A) 和甲醛異化產(chǎn)能 (B) 兩個(gè)途徑上進(jìn)行碳流分配。我們前期的研究結(jié)果[12]表明，途徑A和途徑B的碳流占總甲醇代謝碳流的比例隨誘導(dǎo)溫度的變化而變化。當(dāng)誘導(dǎo)溫度從30 ℃降低到20 ℃時(shí)，由于AOX被激活，絕對甲醇代謝速率增加 1倍以上；與此同時(shí)，途徑A的碳流分配比從43%升至65%，而途徑B的碳流分配比則從57%降低到35%，能量物質(zhì)NADH的利用率大大提高。根據(jù)上述的先知結(jié)果和實(shí)測的甲醇消耗速率，利用式4可計(jì)算得到30 ℃/20 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的途徑A (同化) 和途徑 B (異化產(chǎn)能) 的各速率參數(shù)以及能量利用效率h，以上計(jì)算參數(shù)歸納總結(jié)于表1和圖5中。這時(shí)，NADH生成量與消耗于途徑B中的甲醇量存在以下計(jì)量系數(shù)關(guān)系，即每消耗1摩爾C (甲醇) 分子產(chǎn)生2摩爾NADH。

圖3 不同誘導(dǎo)條件對甲醛異化途徑中的關(guān)鍵酶FLD和FDH活性的影響Fig. 3 Time course of specific FLD and FDH activities under different induction strategies. Open symbols: methanol induction at 30 °C (○) and 20 °C (△); filled symbols: methanol/sorbitol co-feeding at 30 °C with sorbitol feeding rate of 0.785 g/(L·h) (●) and 1.437 g/(L·h) (■), respectively.

圖4 不同誘導(dǎo)條件對TCA循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶IDH和α-KGDHC活性的影響Fig. 4 Time course of specific IDH and α-KGDHC activities under different induction strategies. Open symbols: methanol induction at 30 °C (○) and 20 °C (△); filled symbols: methanol/sorbitol co-feeding at 30 °C with sorbitol feeding rate of 0.785 g/(L·h) (●) and 1.437 g/(L·h) (■), respectively.

圖5 不同誘導(dǎo)條件下畢赤酵母的代謝途徑和碳/能量代謝模型Fig. 5 Major metabolic pathways and simplified metabolic/energy regeneration model of P. pastoris under different induction strategies. Numerical values represents the absolute/stable rates of methanol consumption, sorbitol consumption, carbon flow in protein synthesis route, and NADH production (broken lines), respectively, in mmol/L/h base. a: pure methanol induction at 30 °C (run #1 in Table 1); b: pure methanol induction at 20 °C (run #3 in Table 1); c: methanol/sorbotol co-feeding (run #5 in Table 1).

前面的代謝酶學(xué)分析結(jié)果表明，30 ℃甲醇/山梨醇 (Sor) 共混流加時(shí)，TCA循環(huán) (途徑 C)被打通、而甲醛異化供能途徑 (途徑 B) 則被弱化。這里，按照公認(rèn)的甲醇代謝利用模式[9-10]，假定甲醇無法進(jìn)入 TCA循環(huán)參與能量物質(zhì)NADH的生成，NADH主要依靠代謝山梨醇、由TCA循環(huán) (途徑C) 產(chǎn)生。同時(shí)，盡管此誘導(dǎo)條件下的甲醛異化供能途徑被大大弱化，但是該途徑并不可能被完全切斷，仍有少量甲醇 (假定碳流分配比為e) 將繼續(xù)進(jìn)入途徑B生成NADH，而大部分甲醇 (1?e) 則用于細(xì)胞和pIFN-α的合成。此時(shí)，來自于途徑C的NADH生成量與山梨醇代謝 (消耗) 量之間存在著式2所示的計(jì)量系數(shù)關(guān)系：每消耗1摩爾C分子也同樣產(chǎn)生2摩爾NADH，并附加有2/3摩爾的ATP直接生成；而來自于途徑B的NADH生成量與消耗于該途徑中的甲醇量依舊存在著式1所示的計(jì)量系數(shù)關(guān)系。另外，如圖5和式3所示，不同誘導(dǎo)條件、不同供能途徑下所產(chǎn)生的 NADH都必須經(jīng)過氧化磷酸化反應(yīng)再生得到ATP (假定P/O比一定，P/O=2~3)，為功能性細(xì)胞和pIFN-α的合成提供能量。如果忽略每摩爾單C附加產(chǎn)生的2/3摩爾ATP的能量貢獻(xiàn)，根據(jù)上述的有關(guān)假定、實(shí)測的甲醇/山梨醇代謝速率、實(shí)測耗氧速率 OUR、再結(jié)合使用物質(zhì)平衡關(guān)系式4~5，則甲醇/山梨醇共混流加條件下的 (途徑A/B/C中) 各主要速率參數(shù)和能量利用效率h就可以得到計(jì)算。此條件下的各計(jì)算參數(shù)也歸納總結(jié)于表1和圖5中。

這里，rNADH、rA、rMeOH和rSor分別代表NADH生成速率、細(xì)胞同化途徑A的碳代謝速率、甲醇代謝速率和山梨醇代謝速率。由于山梨醇(0.5 g/L) 和甲醇濃度 (10 g/L) 的濃度基本控制穩(wěn)定，可假定代謝速率與各自的添加速率基本相等。h代表消耗單位摩爾能量物質(zhì)NADH所能催化的用于目標(biāo)蛋白合成的甲醇量，實(shí)際上，它反映了細(xì)胞的能量利用效率。h越大，能量利用效率就越高。

O2理論消耗速率可按照式5來進(jìn)行計(jì)算。這里，甲醛異化供能途徑 (途徑 B) 中的耗氧反應(yīng)有兩步：第一步是甲醇在 AOX酶的催化和 O2的參與之下，氧化生成甲醛；第2步則發(fā)生在氧化磷酸化反應(yīng)過程中。根據(jù)式1和式3的計(jì)量系數(shù)關(guān)系，并利用實(shí)測的甲醇/山梨醇代謝速率和耗氧速率OUR，最后可由式5推算出甲醇/山梨醇共混流加條件下途徑B的碳流分配比e，進(jìn)而確定此時(shí)的能量利用效率h。這里，根據(jù)相關(guān)的穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)推算得到共混流加條件下途徑 B的碳流分配比e約為 0.30。與 30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)(b=0.57) 相比，共混流加條件下甲醛異化供能途徑的碳流分配比降低到前者的 50%左右，而用于目標(biāo)蛋白合成途徑的碳流分配比則增加了約63%。

圖6顯示了不同誘導(dǎo)條件下，主要中間代謝毒副產(chǎn)物甲醛以及甲酸的胞內(nèi)積累情況。甲醇代謝時(shí) (圖5)，甲醇首先進(jìn)入到細(xì)胞的過氧化物酶體 (Peroxisome) 中，在醇氧化酶AOX的催化作用下與O2發(fā)生反應(yīng)，生成甲醛 (HCHO)。這時(shí)，一部分甲醛在二羥基丙酮合成酶 (DHAS) 的催化下生成二羥基丙酮 (DHA) 和 3-磷酸甘油醛(GAP)，并分泌到過氧化物酶體外，形成目標(biāo)蛋白的主要構(gòu)成成分。另一部分甲醛則直接脫離過氧化物酶體進(jìn)入到液胞內(nèi)，在FLD和FDH的順序作用下，最終氧化生成CO2，同時(shí)生成NADH、為目標(biāo)蛋白的合成提供能量，這部分甲醛將對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。由于甲醇/山梨醇共混流加條件下的AOX活性低，甲醇總代謝速率相對小且走蛋白合成途徑的碳流分配比大，脫離過氧化物酶體而直接進(jìn)入到甲醛異化產(chǎn)能途徑的甲醛量少。盡管此時(shí)FLD和FDH的活性低，但由于途徑B的代謝被弱化 (e?0.3)，少量脫離過氧化物酶體的甲醛依舊可以被完全氧化而沒有積累。此時(shí)胞內(nèi)甲醛和甲酸的濃度最低，對細(xì)胞的毒害最小。而低溫20 ℃、甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下，AOX活性最高，甲醇代謝速率最大。雖然此時(shí)FLD和FDH活性高，轉(zhuǎn)化甲醛的“解毒”能力強(qiáng)，但仍無法完全氧化脫離過氧化物酶體的甲醛。此時(shí)，胞內(nèi)甲醛和甲酸的濃度最高，甲醛對細(xì)胞的毒害作用最為嚴(yán)重。這可能也是相比于甲醇/山梨醇共混流加，低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下 pINF-a抗病毒活性低的一個(gè)重要原因。

圖6 不同誘導(dǎo)條件下甲醛、甲酸物質(zhì)含量時(shí)間變化曲線Fig. 6 Time course of intercellular formaldehyde and formate concentration under different induction strategies. Open symbols: pure methanol induction at 30 °C (○, run #1) and 20 °C (△ , run #3); filled sy mbol: methanol/ sorbitol co-feeding at 30 °C with sorbitol feeding rate of 0.785 g/(L·h) (●, run #5).

圖5、圖6和表1的結(jié)果可以得到以下不同誘導(dǎo)條件下有關(guān)碳和能量代謝的結(jié)論：1) 20 ℃低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的甲醇代謝速率和細(xì)胞同化途徑A的碳代謝速率最大。常溫 (30 ℃) 甲醇/山梨醇共混流加條件下，由于AOX活性受到限制，甲醇代謝速率基本沒有提高。但由于此時(shí)山梨醇完全用來為畢赤酵母的代謝供能，解除了細(xì)胞利用甲醇的供能壓力，同化途徑A的碳代謝速率為常溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)的1.5~2.2倍，達(dá)到低溫誘導(dǎo)時(shí)的43%~59%的水平。2) 與30 ℃常溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)相比較，甲醇/山梨醇共混流加時(shí)的能量物質(zhì)NADH生成速率的提升幅度可達(dá)48%~91%，且低速山梨醇流加時(shí)的能量利用效率h也有很大提高 (0.38?0.57)，有利于 pINF-a的持續(xù)積累。3) 甲醇/山梨醇共混流加條件下，山梨醇通過TCA循環(huán)大量產(chǎn)生能量物質(zhì)NADH，而甲醛異化供能途徑則被弱化 (弱化程度約50%)。此時(shí)，甲醇代謝過程中公認(rèn)的毒副產(chǎn)物甲醛的生成得到抑制，這也為 pINF-a的持續(xù)積累創(chuàng)造了良好的環(huán)境。4) 與20 ℃低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)相比，甲醇/山梨醇共混流加下的理論耗O2速率小、只有前者的70%左右。低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下，高耗氧速率導(dǎo)致溶解氧濃度過低，在不使用富氧空氣的情況下，DO只能長期處于極低的水平 (表1)。而由于畢赤酵母的高好氧特性，過低的DO會(huì)對外源基因的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響[10]。另外，目標(biāo)蛋白的正確表達(dá)依賴于二硫鍵的形成，而二硫鍵的形成則需要蛋白分泌機(jī)構(gòu)處于較高的氧化狀態(tài)[23]。因此，通過使用共混流加策略降低供氧需求、使 DO始終保持在適中 (10%~20%) 水平，還可以避免因供氧不足所引起的蛋白表達(dá)效率低下的問題。5) 低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)雖然也可以提高pINF-a的表達(dá)水平和抗病毒活性，但是，它的操作成本高，特別是夏季生產(chǎn)、存在低溫冷卻水大量需求等問題。甲醇/山梨醇共混流加策略可在常溫、使用空氣的條件下進(jìn)行，與低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)相比，發(fā)酵成本低，整體發(fā)酵性能顯著提高。

3 結(jié)論

通過對不同誘導(dǎo)條件下畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)pINF-a過程的AOX酶活、甲醛異化產(chǎn)能途徑關(guān)鍵酶和TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的對比分析發(fā)現(xiàn)，30 ℃、甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)下，主要供能途徑由甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)的甲醛異化途徑轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)，在緩解細(xì)胞供能壓力的同時(shí)，還大幅提高了進(jìn)入目標(biāo)蛋白合成途徑的甲醇分配比例。此時(shí)，最高抗病毒活性達(dá)到1.8×107IU/mL，是30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下最高活性的100倍以上。

甲醇/山梨醇共混流加條件下：與30 ℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)相比，NADH生成速率的提升幅度可達(dá)48%~91%，且低速山梨醇流加時(shí)的能量利用效率h也有很大提高，有利于pINF-a的持續(xù)積累；甲醛異化供能途徑被弱化，毒副產(chǎn)物甲醛的生成積累得到抑制，為 pINF-a蛋白的持續(xù)積累創(chuàng)造了良好的環(huán)境；理論耗O2速率較低，只有20 ℃低溫甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下的72%~75%，使發(fā)酵可以在常溫、使用空氣供氧的條件下進(jìn)行，發(fā)酵成本明顯下降。

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