范翠英，馮利興，張冬梅，潘素娜，劉璇，果德安，樊金玲

1 河南科技大學(xué)食品與生物工程系，河南 洛陽 471003

2 中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203

泛素-蛋白酶體通路 (Ubiquitin-proteosome pathway) 是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的重要途徑。蛋白酶體 (Proteasomes) 普遍存在于所有真核細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，最常見的蛋白酶體的形式是26S蛋白酶體，由一個(gè)20S催化亞基與2個(gè)19S調(diào)節(jié)亞基組成，對(duì)肽鍵的裂解作用是通過20S催化亞基N末端氨基酸殘基的親和反應(yīng)來完成[1]。擬降解的靶蛋白經(jīng)過泛素化后，先被19S亞單位識(shí)別，隨后進(jìn)入20S催化中心被降解成3~22個(gè)氨基酸片段并釋放出游離的泛素[2]。

由于蛋白酶體參與降解細(xì)胞內(nèi)多種目標(biāo)靶蛋白，因此其功能調(diào)節(jié)可以影響基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等多種生理過程，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞的增殖、分化及惡變均有重要影響[3-4]。因此蛋白酶體將成為影響細(xì)胞功能的重要藥物靶標(biāo)[5]。例如，尋找能夠與20S催化亞基單位共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而改變其酶切位點(diǎn)活性的蛋白酶體抑制劑已成為近年來惡性腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。第一個(gè)進(jìn)入臨床的蛋白酶體抑制劑是英國劍橋Millennium Pharmaceuticas公司的二肽硼酸鹽類藥物硼替佐米(Bortezomib)。這是一種緩慢作用于糜蛋白酶位點(diǎn)的可逆抑制劑。還有2種處于臨床前研究的新藥，salinosporamide A (NPI-0052，圣地亞哥) 和PR-171 (Proteolix，舊金山)。其中salinosporamide A是口服藥物，它不同于硼替佐米，是一種自然提取物，類似于乳胞素，能夠不可逆地作用于蛋白酶體的活性亞基，而且其對(duì)蛋白酶體催化活性的抑制具有特異性。PR-171是一種合成的能夠不可逆地作用于糜蛋白酶位點(diǎn)的抑制劑，來源于環(huán)氧霉素，是目前已知的選擇性最強(qiáng)的蛋白酶體抑制劑。

重組表達(dá)蛋白酶體的活性亞基，可以用于在體外高通量、快速地篩選可能具有蛋白酶體抑制作用的化合物。本研究構(gòu)建了蛋白酶體20S催化亞基PSMB1 (全長726 bp) 的表達(dá)質(zhì)粒，在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)PSMB1的可溶性表達(dá)，利用固相化金屬親合層析 (Immobilized metal-affinity chromatography，IMAC) 柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物純化，獲得了純度較高的重組蛋白。質(zhì)譜鑒定證實(shí)所表達(dá)的重組蛋白氨基酸序列完全正確。BIAcore (Biomolecular interaction analysis) 分析表明PSMB1重組蛋白對(duì)不同化合物表現(xiàn)出差異的結(jié)合能力。本研究為建立以蛋白酶體為分子靶點(diǎn)篩選特異性抑制劑的體外篩選模型提供了純化的PSMB1重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α/BL21 (DE3) 購自北京全式金生物有限公司。表達(dá)載體pET28a (+) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。PSMB1 cDNA購于Thermo公司。

1.1.2 酶和主要試劑

EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶購于北京NEB公司。T4 DNA連接酶、Taq酶、PCR試劑盒均購于 TaKaRa公司。質(zhì)粒提取及純化試劑盒購于博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增引物及 DNA測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。IPTG、卡那霉素為鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。固相化金屬親合層析(Immobilized metal-affinity chromatography，IMAC) 柱購自上海 Bio-Rad公司。二硫蘇糖醇(DTT) 和碘乙酰胺為 Sigma公司產(chǎn)品，甲酸(FA) 購自美國TEDIA公司，胰蛋白酶 (Trypsin)購自美國 (Promega) 公司，乙腈為色譜純(Honeywell)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。其他試劑均為分析純。

1.1.3 NanoLC-MS/MS分析儀器

Tempo nano MDLC色譜系統(tǒng)、質(zhì)譜儀 (4000 QTRAP LC-MS/MS) 美國Applied Biosysterms公司；C18反相分析柱，MICHROM Magic C18 5 μm 100? 0.075 mm×150 mm美國MICHROM公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pET28a-PSMB1的構(gòu)建

根據(jù) GenBank中 PSMB1基因的編碼序列(Accession No. NM_002793. 3)及表達(dá)載體pET28a (+) 的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物：上游：5'–CGGAATTC ATGTTGTCCTCTAC AGCCATGTATTC-3' (下劃線為 EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))。下游：5'–CCCTCGAG CGTCCTTCCTTAA GGAAACAGTTTCCT-3' (下劃線為 Xho Ⅰ酶切位點(diǎn))。以PSMB1 cDNA (全長726 bp) 為模板，擴(kuò)增出目的基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30s，58 ℃ 30s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。膠回收純化的PCR產(chǎn)物采用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切，再經(jīng)過電泳回收純化后與經(jīng)過同樣處理的pET28a (+) 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆，挑選單菌落，小提質(zhì)粒后經(jīng)PCR及雙酶切分析驗(yàn)證后，進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 重組蛋白的可溶性表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒 pET28a-PSMB1轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21 (DE3)，挑選單菌落，接種于5 mL LB/Km (50 μg/mL) 液體培養(yǎng)基，1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.8左右，加入終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) (20 ℃)，每隔1 h分別取樣，6 h后剩余菌體過夜誘導(dǎo)。次日，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。其中以不加誘導(dǎo)劑的菌體為對(duì)照。

1.2.3 目的蛋白的純化及NanoLC-MS/MS分析

誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)離心收集后，將沉淀重懸于預(yù)冷的裂解緩沖液 (300 mmol/L KCl，50 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L咪唑，pH 8.0)，超聲破碎，12 000 r/min離心30 min后收集上清，經(jīng)0.45 μm膜過濾后用Profinity IMAC柱純化。親合柱先用結(jié)合緩沖液平衡 10個(gè)柱體積，上樣流速為1 mL/min，然后依次用含10 mmol/L、30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗去柱子上非特異性結(jié)合的蛋白，脫鹽緩沖液 (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，8.1 mmol/L KH2PO4，pH 7.4) 脫鹽，最后用含250 mmol/L 咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。依次收集穿透液 (A)、洗雜液 (B)、洗雜液 (C)、洗脫液 (D)，純化的蛋白經(jīng)超濾濃縮后以Bradford測(cè)定蛋白含量，得到最終的目的蛋白。12% SDS-PAGE分析目的蛋白。

1.2.4 NanoLC-MS/MS 分析

切取膠內(nèi)目標(biāo)蛋白條帶，用含 30%乙腈/ 100 mmol/L (NH4)2CO3脫色，真空干燥脫水。將新配制的含100 mmol/L DTT的100 mmol/L碳酸氫銨溶液加入脫色干燥后的膠片管內(nèi)，使膠片水化。56 ℃水浴，還原l h，棄去DTT溶液，加入乙腈放置5 min吸去，真空干燥15 min。加入100 μL 55 mmol/L碘乙酰胺的100 mmol/L碳酸氫銨溶液，烷基化半胱氨酸殘基上的巰基。室溫暗室中放置l h，棄去上清液，重復(fù)上述步驟。在完全脫水的膠片中加入 10 ng/μL胰蛋白酶液適量，4 ℃放置30 min使酶液完全吸收，再補(bǔ)加25 mmol/L碳酸氫銨緩沖液適量，37 ℃孵育過夜。加入100 μL 60%乙腈/0.1 FA，超聲提取15 min，吸取上清液，反復(fù)3次，合并3次提取液，真空濃縮至干。

采用API 4000 Qtrap 串聯(lián)四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀與在線Tempo nano MDLC色譜系統(tǒng)相連，樣品以 5 μL/min的流速進(jìn)樣，300 nL/min流速?zèng)_洗脫鹽。流動(dòng)相A液：98%水，2%乙腈，0.1%甲酸；流動(dòng)相B液：2%水，98%乙腈，0.1%甲酸。液動(dòng)相洗脫梯度：5% 2 min，5%~ 10% 6 min，10%~30% 42 min，30%~50% 10 min，50%~95% 15 min，95% 20 min，95%~5% 5 min，5% 5 min。MS選用 IDA (Information dependent aequisition) 陽離子模式，儀器參數(shù)設(shè)置如下：Curtain gas (20)，Ionspray voltage (2 300 V)，Ion source gas (30)，Interface heater temperature (150 ℃)，Collision gas (High)，Declustering potential (80)，Entrance potential (10) and Collision cell exit potential (15)。第1級(jí)四極桿和第3級(jí)四極桿掃描分辨率設(shè)置為“unit”；選擇目標(biāo)離子傳輸窗口為0.7 Da；每對(duì)離子對(duì)處理時(shí)間為50 ms。

1.2.5 BIAcore分析重組 PSMB1與雷公藤紅素的結(jié)合活性

BIAcore技術(shù)是基于一種表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR) 的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感器分析技術(shù)，它利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，探測(cè)生物分子之間是否發(fā)生作用以及反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在研究兩分子的相互作用時(shí)，將一種分子固定在傳感器表面，而另一種分子的溶液流過其表面，兩種分子的結(jié)合會(huì)使傳感器表面的折射率改變，從而檢測(cè)兩分子間的相互作用。

本研究通過氨基偶聯(lián)方法將PMSB1偶聯(lián)到CM5芯片的FC4通道上。HBS-EP作為工作緩沖液，PMSB1用10 mmol/L NaAC (pH 4.13) 1∶15稀釋。芯片表面用0.2 mol/L EDC (活化劑) 和 50 mmol/L NHS (活化劑) 1∶1混合以10 μL/min的流速進(jìn)樣7 min，然后注射受體溶液，以1 mol/L乙醇胺 (pH 8.5)，進(jìn)樣7 min，封閉活化的芯片表面。用HBS-EP緩沖液稀釋待測(cè)配體濃度為1 μmol/L和10 μmol/L，離心后自動(dòng)進(jìn)樣，檢測(cè)不同濃度配體與受體的結(jié)合活性。對(duì)有結(jié)合活性的配體進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PSMB1基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增PSMB1 cDNA，瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約為726 bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖1)。

2.2 表達(dá)載體pET28a-PSMB1的構(gòu)建及鑒定

成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PSMB1，經(jīng)EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析可見約726 bp和5 369 bp兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖2)。

2.3 重組蛋白PSMB1的誘導(dǎo)表達(dá)

pET28a-PSMB1轉(zhuǎn)化宿主菌 BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)12% SDS-PAGE分析可見一條分子量約為27 kDa的明顯的新增表達(dá)條帶。根據(jù)表達(dá)條帶的濃度變化趨勢(shì)選擇過夜誘導(dǎo)為最佳培養(yǎng)時(shí)間 (圖3)。

2.4 表達(dá)蛋白的純化

重組蛋白利用IMAC柱親和純化，依次用不同濃度的咪唑洗脫，分別收集穿透液 (A)、洗雜液 (B)、洗雜液 (C)、洗脫液 (D) 進(jìn)行 SDSPAGE分析。在上清與洗脫液洗脫后的回收液中均發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白，大小約為27 kDa，與預(yù)期結(jié)果吻合。純化后的蛋白經(jīng)超濾離心后，Bradford測(cè)定蛋白含量為3.5 g/L。上樣20 μg，幾乎無雜帶，蛋白純度大于95% (圖4)。

2.5 NanoLC-MS/MS分析PSMB1重組蛋白

從SDS-PAGE膠上切取PSMB1融合蛋白片段，膠內(nèi)酶解后，進(jìn)入NanoLC-MS/MS質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)獲得的MS/MS數(shù)據(jù)由ProteinPilot?3.0軟件數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)處理，蛋白鑒定置信度設(shè)置為95%，共檢測(cè)到34個(gè)肽段。如表1所示。表明所表達(dá)的蛋白即為PSMB1融合蛋白。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products. 1: DNA marker (Marker Ⅲ); 2: PCR product of PSMB1.

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-PSMB1酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pET28a-PSMB1 by enzyme digestion. 1: marker III; 2–3: pET28a-PSMB1 digested with EcoR I and Xho I.

圖3 PSMB1的誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 3 Induced expression of PSMB1. 1,10: marker; 2: total protein before induction; 3–9: total protein in 1?6 hours after induction; 10: total protein overnight induction.

圖4 PSMB1重組蛋白的純化Fig. 4 Purification of PSMB1 recombinant protein. 1: marker; 2: precipitate of cell lysate; 3: culture supernatant; 4: flowthrough (A); 5: wash (B); 6: wash (C); 7: concentrated purification protein (D).

圖5是表 1中序列為 DVFISAAER DVYTGDALR (MH2+=999.39) 的MS/MS分析結(jié)果。

2.6 重組蛋白PSMB1與雷公藤紅素的體外結(jié)合

BIAcore初篩結(jié)果顯示，不同的化合物 (配體) 與受體PSMB1的結(jié)合能力各不相同，結(jié)果見表2。

其中，雷公藤紅素 (Celastrol) 與受體PSMB1最強(qiáng)，響應(yīng)值達(dá)27RU，且表現(xiàn)出濃度依賴性。不同濃度的雷公藤紅素 (0、2.40、3.43、4.90、7.0、10.0 μmol/L) 與PSMB1之間的相互作用如圖6所示。圖中從上到下的曲線依次是濃度由高到低的雷公藤紅素在PSMB1表面流過的響應(yīng)值。用 Biacore3000分析軟件中的 1∶1 Langmuir結(jié)合模型對(duì)圖6的曲線進(jìn)行擬合，得到ka(1/Ms) 值為 15.7，kd(1/s) 值為 0.0142，KD(μmol/L) 為903，Chi2為1.09。

表1 重組PSMB1蛋白NanoLC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 1 Identification of PSMB1 recombinant protein by NanoLC-MS/MS

表1 重組PSMB1蛋白NanoLC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 1 Identification of PSMB1 recombinant protein by NanoLC-MS/MS

Number Sequence Score 1AGGSASAMLQPLLDNQVGFK 20 2AMTTGAIAAMLSTILYSR 24 3DVFISAAERDVYTGDALR 14 4GAVYSFDPVGSYQR 19 5KNMQNVEHVPLSLDR 19 6LTDKTVIGCSGFHGDCLTLTK 16 7LVKDVFISAAER 17 8MYKHSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR 18 9RFFPYYVYNIIGGLDEEGKG 19 10TVIGCSGFHGDCLTLTK 18 11DVFISAAER 12 12EGIREETVSLR 13 13EGIREETVSLRK 12 14FISAAERDVYTGDALR 13 15PLLDNQVGFK 12 16FFPYYVYNIIGGLDEEGK 12 17TTGAIAAMLSTILYSR 13 18SLDRAMRLVKDVFISAAER 13 19LKMYKHSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR 13 20RFFPYYVYNIIGGLDEEGKGAVYSFDPVGSYQR 13 21AMLSTILYSRRFFPYYVYNIIGGLDEEGK 12 22DVFISAAERDVYTGDALR 12 23FSPYVFNGGTILAIAGEDFAIVASDTR 19 24KNMQNVEHVPLSLDR 15 25NMQNVEHVPLSLDR 19 26RFFPYYVYNIIGGLDEEGK 18 27KHDKSASDALR 12 28KRQSPEPSPVTLGR 12 29DSLNSDCLTSFKITDLGK 12 30AENTRLNAELLK 12 31HSNNKAMTTGAIAAMLSTILYSR11 32NGFLLDGFPR 10 33SVPAAEPEYPK 10 34KEPKNLVWRDVSLGQTSRTPR 10

表2 不同配體與PSMB1的結(jié)合能力比較Table 2 The comparation of binding ability between different ligands and PSMB1

圖6 celastrol與PSMB1結(jié)合的BIAcore分析Fig. 6 BIAcore analysis of interactions between celastrol and PSMB1.

3 討論

本研究選取帶有六聚組氨酸標(biāo)簽的 pET28a (+) 原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了PSMB1在大腸桿菌BL21 (DE3) 內(nèi)的可溶性表達(dá)。由于pET28a (+)載體N端帶有His-tag標(biāo)簽，可以直接采用Ni+親和層析實(shí)現(xiàn)重組蛋白的純化，且組氨酸標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白結(jié)構(gòu)影響小，不需要從蛋白中切除。目的蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以可溶性形式表達(dá)，再利用His親和柱對(duì)PSMB1重組蛋白直接進(jìn)行純化，一步法純化可達(dá)到 95%以上的純度，可直接用于BIAcore分析，篩選潛在的具有蛋白酶體抑制劑活性的化合物。在本研究中，對(duì)重組PSMB1融合蛋白的氨基酸序列的鑒定采用的是 NanoLC-MS/MS方法，蛋白鑒定置信度設(shè)置為95%。該檢測(cè)方法與常規(guī)的Western blotting等方法相比，檢測(cè)快速、靈敏、準(zhǔn)確，極大地提高了鑒定結(jié)果的可靠性。此外，蛋白酶體抑制劑篩選主要采用連續(xù)熒光監(jiān)測(cè)法，通過測(cè)定蛋白酶體活性來尋找對(duì)蛋白酶活性影響的化合物，但該方法不能確證化合物是否與蛋白酶體發(fā)生結(jié)合，以及與哪個(gè)亞基結(jié)合。本研究中利用BIAcore直接檢測(cè)蛋白酶體亞基與化合物小分子之間的相互作用，進(jìn)而篩選特異性蛋白酶體抑制劑，無需借助任何標(biāo)記物 (酶標(biāo)或熒光底物) 也不需要對(duì)所研究蛋白質(zhì)做任何修飾即可監(jiān)測(cè)生物分子之間的相互作用[6]。BIAcore結(jié)果還可以提供關(guān)于結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程數(shù)據(jù)，且測(cè)量周期短，這些都是其他技術(shù)無法比擬的。

雷公藤紅素 (Celastrol) 又名南蛇藤醇，是從雷公藤根部分離到的三萜類色素[7]。近年來因?yàn)槠渚哂袕V譜的抗炎和抗氧化作用，被廣泛地應(yīng)用于哮喘、自身免疫性及神經(jīng)性疾病的治療[8-15]。雷公藤紅素還可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其死亡[16-18]。有報(bào)道指出，雷公藤紅素可以顯著抑制大鼠20S中的β5催化亞基及PC-3、LNCaP細(xì)胞中的26S蛋白酶體活性[19]，但其分子機(jī)制還不太清楚。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以作用于人20S蛋白酶體中的PSMB1催化亞基。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步深入研究雷公藤紅素抑制蛋白酶體活性的分子機(jī)制提供了研究方向。

總之，本研究建立了重組表達(dá)、純化人蛋白酶體亞基PSMB1的方法，并初步試用于體外篩選具有蛋白酶體抑制作用的化合物。本研究結(jié)果為建立快速、高通量的蛋白酶體抑制劑篩選平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于對(duì)已知的蛋白酶體抑制劑進(jìn)行作用機(jī)制研究。

REFERENCES

[1] 顧光華, 孔祥. 泛素蛋白酶體通路以及蛋白酶抑制劑對(duì)NF-κB信號(hào)通路作用的研究進(jìn)展. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2009, 13(5): 114?116.

[2] Glickman MH, Ciechanover A. The ubiquitinproteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev, 2002, 82(2): 373?428.

[3] Ciechanover A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin–proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death Differ, 2005, 12(9): 1178?1190.

[4] Smalle J, Vierstra RD. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway. Annu Rev Plant Biol, 2004, 55(1): 555?590.

[5] Adams J. The proteasome: a suitable antineoplastic target. Nat Rev Cancer, 2004, 4(5): 349?360.

[6] Deng HW, Guo Y, Sun Y, et al. A novel small molecule ligand for epidermal growth factor receptor targeting. Prog Biochem Biophys, 2005, 32(2): 180?186.鄧宏偉, 郭妍, 孫燁, 等. 靶向表皮生長因子受體的全新小分子配體篩選. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2005, 32(2): 180?186.

[7] 程薇, 馬保根, 張茵, 等. 雷公藤紅素抗腫瘤研究進(jìn)展. 中國醫(yī)藥, 2008, 3(6): 383?384.

[8] Tao X, Younger J, Fan FZ, et al. Benefit of an extract of Tripterygium wilfordii Hook F in patients with rheumatoid arthritis: a double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Rheum, 2002, 46(7): 1735?1743.

[9] Li H, Jia YF, Pan DJ, et al. Effect of tripterine on collagen-induced arthritis in rats. Acta Pharm Sin, 1997, 18(3): 270?273.

[10] Li H, Zhang YY, Huang XY, et al. Beneficial effect of tripterine on systemic lupus erythematosus induced by active chromatin in BALB/c mice. Eur J Pharmacol, 2005, 512(2/3): 231?237.

[11] Xu X, Wu Z, Xu C, et al. Observation on serum anti-double stranded DNA antibodies of tripterine in systemic lupus erythematosus of (NZB×W) F1 mice. Ann Rheum Dis, 2003, 62(4): 377?378.

[12] Liu RL, Liu ZL, Li Q, et al. The experimental study on the inhibitory effect of tripterine on airway inflammation in asthmatic mice. Chin J Tuberc Respir Dis, 2004, 27(3): 165?168.

[13] Pinna GF, Fiorucci M, Reimund JM, et al. Celastrol inhibits pro-inflammatory cytokine secretion in Crohn’s disease biopsies. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(3): 778?786.

[14] Cleren C, Calingasan NY, Chen J, et al. Celastrol protects against MPTP- and 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity. J Neurochem, 2005, 94(4): 995?1004.

[15] Allision AC, Cacabelos R, Lombardi VRM, et al. Celastrol, a potent antioxidant and anti-inflammatory drug, as a possible treatment for Alzheimer’s disease. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2001, 25(7): 1341?1357.

[16] Chang FR, Hayashi K, Chen IH, et al. Antitumor agents. 228. Five new agarofurans, Reissantins A-E, and cytotoxic principles from Reissantia buchananii. J Nat Prod, 2003, 66(11): 1416?1420.

[17] Zhou YX, Huang YL, Xu QN, et al. Several monomes from Tripterygium wilfordii inhibit proliferation of glioma cells in vitro. Chin J Cancer, 2002, 21(10): 1106?1108.

[18] Nagase M, Oto J, Sugiyama S, et al. Apoptosis induction in HL-60 cells and inhibition of topoisomerase II by triterpene celastrol. Biosci Biotechnol Biochem, 2003, 67(9): 1883?1887.

[19] Yang HJ, Chen D, Cui QZC, et al. Celastrol, a triterpene extracted from the Chinese “Thunder of God Vine,”is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice. Cancer Res, 2006, 66(9): 4758?4765.