熊強(qiáng)，徐晴，顧帥，李霜

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009

絲狀真菌[1](Filamentous fungi) 是一類(lèi)重要的工業(yè)微生物，產(chǎn)品涵蓋了工業(yè)酶制劑 (如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等)、有機(jī)酸、抗生素等，生產(chǎn)應(yīng)用極其廣泛。

絲狀真菌的生長(zhǎng)形態(tài)對(duì)細(xì)胞代謝途徑、產(chǎn)物積累及分離提取均有顯著影響，因此如何控制絲狀真菌的生長(zhǎng)形態(tài)，最大化提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量成為研究的熱點(diǎn)。然而，生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)育作為絲狀真菌生命體的一種本能表現(xiàn)形式，受到影響因素多且過(guò)程復(fù)雜。如何理解并控制這種過(guò)程成為發(fā)酵調(diào)控的難點(diǎn)。

在現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中，以分子生物學(xué)為主要手段的生理學(xué)研究深入揭示了絲狀真菌的遺傳代謝機(jī)理和生長(zhǎng)行為，數(shù)學(xué)模型的引入可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分析和診斷生物發(fā)酵過(guò)程，而工程學(xué)在生物發(fā)酵過(guò)程上的運(yùn)用則大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率、以及生產(chǎn)強(qiáng)度[2]。2010年，國(guó)外學(xué)者Wucherpfennig、Krull等分別對(duì)絲狀真菌形態(tài)調(diào)控相關(guān)研究做了綜述[3-4]，主要集中于描述細(xì)胞形態(tài)與環(huán)境以及目標(biāo)產(chǎn)物三者之間的相互關(guān)系；Wucherpfennig與 Driouch于2010年以及2011年提出形態(tài)工程學(xué) (Morphology engineering) 的概念[3,5-6]，使得應(yīng)用工程學(xué)理念調(diào)控形態(tài)獲得更有效的產(chǎn)物積累成為一種研究趨勢(shì)。

本文嘗試以絲狀真菌的形態(tài)為闡述對(duì)象，分別從生理學(xué)和工程學(xué)角度揭示絲狀真菌形態(tài)生長(zhǎng)控制的基本原理，為發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化提供策略。

1 絲狀真菌生長(zhǎng)的生理機(jī)制

1.1 絲狀真菌生長(zhǎng)過(guò)程的生物學(xué)原理

絲狀真菌的形態(tài)發(fā)育過(guò)程被認(rèn)為是高度極化生長(zhǎng)的過(guò)程，主要表現(xiàn)在2個(gè)方面，即菌絲體分支形成的多極性以及尖端延伸的不對(duì)稱(chēng)性[7]。

絲狀真菌在極性生長(zhǎng)的過(guò)程中，多種細(xì)胞骨架成分、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、細(xì)胞器、信號(hào)分子以及能量分子都會(huì)參與[8]。通常認(rèn)為，絲狀真菌的細(xì)胞骨架由微絲肌動(dòng)蛋白 (Actin filaments)和微管 (Microtubules) 構(gòu)成，運(yùn)輸?shù)鞍滓约昂铣杉?xì)胞壁所需物質(zhì)的分泌小泡沿著微管運(yùn)輸至頂體 (Spitzenk?rper)。頂體是指菌絲體尖端具有豐富囊泡的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部含有各種囊泡、核糖體、不同的功能蛋白質(zhì)等等[9]。頂體在細(xì)胞的延伸與分支的形成過(guò)程中扮演著重要角色，它決定了細(xì)胞生長(zhǎng)的中心及方向，同時(shí)也是組成微管和微絲肌動(dòng)蛋白囊泡的轉(zhuǎn)換站[10]。研究發(fā)現(xiàn)，只有在快速生長(zhǎng)的菌絲體尖端才有頂體的存在。

在進(jìn)行物質(zhì)合成時(shí)，微絲肌動(dòng)蛋白會(huì)固定在頂體的中央，然后將合成組織的囊泡運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)膜表面，在細(xì)胞質(zhì)膜表面進(jìn)行物質(zhì)的合成。附著于頂體上的由多種蛋白組成的極性體(Polarisome) 在細(xì)胞核的分裂中起關(guān)鍵作用并控制著菌絲體的最大極性生長(zhǎng)速率[11]。

頂體是一個(gè)富含囊泡組織的結(jié)構(gòu)，其囊泡包括幾丁體、富含鈣的小泡以及其他不明成分的小泡。一種機(jī)理認(rèn)為，菌絲體分支的產(chǎn)生是由于大量的囊泡在菌絲體的尖端或者其他部位非正常聚集，超過(guò)了其生長(zhǎng)部位的容納能力，為了容納這些小泡，尖端一分為二，分支形成[12]。

分子生物學(xué)的發(fā)展使得對(duì)絲狀真菌形態(tài)的認(rèn)識(shí)逐步深入到分子層面。以曲霉屬Aspergillus為例，與曲霉屬形態(tài)控制相關(guān)的基因及其功能如表1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的極化生長(zhǎng)受多個(gè)基因控制。在基因的表達(dá)過(guò)程中，受到Ca2+離子濃度、氧分壓、胞內(nèi)能量水平等因素的控制[7]。盡管通過(guò)改變形態(tài)控制基因或調(diào)節(jié)形態(tài)基因的表達(dá)仍然難以獲得理想的絲狀真菌形態(tài)；但是，對(duì)于我們從分子生理層面認(rèn)識(shí)和理解絲狀真菌的形態(tài)發(fā)育機(jī)制卻意義重大。

1.2 絲狀真菌的形態(tài)學(xué)描述

絲狀真菌的生長(zhǎng)形態(tài)描述沒(méi)有既定的規(guī)則，一般可分為宏觀形態(tài)[14](Macro-morphology) 與微觀形態(tài)[15](Micro-morphology)。

1.2.1 絲狀真菌的宏觀形態(tài)

以米根霉Rhizopus oryzae生長(zhǎng)形態(tài)為例，宏觀形態(tài)中所描述的分散菌絲體 (Dispersed mycelium)、球狀菌絲體 (Pellet)、還有團(tuán)簇狀菌絲體 (Clump or flock) 電鏡圖片如圖1所示。

分散菌絲體表現(xiàn)為單個(gè)生長(zhǎng)的菌絲體；菌球是圓形的、穩(wěn)定的、規(guī)則的菌絲體聚集體，在不同菌球的表面有不同特征，表現(xiàn)為光滑或者毛糙；團(tuán)簇狀菌絲體也是菌絲體的一種聚集體形式，但是聚集的機(jī)制和類(lèi)型表現(xiàn)為非規(guī)則性和隨機(jī)性。

圖1 米根霉Rhizopus oryzae的宏觀形態(tài)Fig. 1 Macro-morphology of Rhizopus oryzae.

1.2.2 絲狀真菌的微觀形態(tài)

微觀形態(tài)特指宏觀形態(tài)的微觀組成以及微觀結(jié)構(gòu)，包括菌絲體的直徑、分支頻率、尖端分支情況，以及生理學(xué)上的結(jié)構(gòu)分布情況等[15]。

菌絲體的微觀形態(tài)與其生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的代謝分泌具有緊密關(guān)聯(lián)；因此，可用相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型來(lái)描述其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。微觀形態(tài)的動(dòng)力學(xué)描述一般牽涉菌絲體的總長(zhǎng)度 (Total hyphal length) L，菌絲體尖端數(shù)量 (Amount of tips) n，主菌絲體長(zhǎng)度 (Main length) Lm，等等。與微觀形態(tài)相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)如圖2所示。早期的經(jīng)典模型認(rèn)為[16]，細(xì)胞壁的合成推動(dòng)菌絲體的延伸和生長(zhǎng)，而細(xì)胞壁的合成依賴于細(xì)胞中囊泡 (Vesicle) 的合成速率及其運(yùn)輸至尖端的速率。菌絲體的延伸與分支形成存在關(guān)聯(lián)，定義單位尖端數(shù)量的菌絲體長(zhǎng)度為 HGU (Hyphal growth unit)，有：

圖2 米根霉Rhizopus oryzae微觀形態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Micro-morphology of a growing mycelium of Rhizopus oryzae.

在菌絲體的初期生長(zhǎng)階段，細(xì)胞壁的合成是限速步驟，隨著菌絲體長(zhǎng)度的增長(zhǎng)，囊泡運(yùn)輸需要的時(shí)間增長(zhǎng)，此時(shí)囊泡的運(yùn)輸限制了菌絲體的延長(zhǎng)。假設(shè)囊泡以恒速運(yùn)輸，因此，菌絲體將以線性增長(zhǎng)的方式延伸，當(dāng)囊泡運(yùn)輸速率超過(guò)菌絲體增長(zhǎng)速率，囊泡在菌絲體的尖端聚集，達(dá)到一定的零界點(diǎn)，便會(huì)產(chǎn)生新的分支。分支發(fā)生的過(guò)程是與菌絲體的總長(zhǎng)度相偶聯(lián)的，用Kbran(菌絲體分支生長(zhǎng)常數(shù)μm/h) 來(lái)表征這種偶聯(lián)關(guān)系：

菌絲體的極化生長(zhǎng)也取決于尖端的生長(zhǎng)與分支的形成。尖端生長(zhǎng)以qtip(菌絲體尖端生長(zhǎng)常數(shù)μm/h) 的速率恒定進(jìn)行：

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)HGU為穩(wěn)態(tài)，菌絲體的延伸以恒定的生長(zhǎng)速度μ (菌絲體生長(zhǎng)速率h?1)進(jìn)行。即有：

解方程 (1)、(2)、(3)、(4)，便可得到：

求解所得的式 (5) 也印證了機(jī)理的假設(shè)，因此在該模型中，用數(shù)學(xué)的方法將菌絲分支等生理現(xiàn)象與生長(zhǎng)的關(guān)系進(jìn)行了完美的闡釋?zhuān)鋺?yīng)用非常廣泛。但是，該模型也存在一定的缺陷，如囊泡在胞內(nèi)的擴(kuò)散運(yùn)輸并沒(méi)有得到有力證據(jù)，基于囊泡恒速運(yùn)輸?shù)募僭O(shè)也是值得商榷的。所以，Nielsen等在菌絲體微觀形態(tài)的描述中引入了一套新的體系。他認(rèn)為菌絲體的尖端延伸是一個(gè)高度極化的過(guò)程，而且菌絲體分支的產(chǎn)生是不相關(guān)的隨機(jī)事件[17]。定義2個(gè)分支產(chǎn)生事件間的時(shí)間差為t，確定模擬時(shí)間的步長(zhǎng)為Dt，如果隨機(jī)數(shù)在區(qū)間[0；1–exp (-qbranDt)]內(nèi)小于Dt，則新的分支產(chǎn)生，選擇該時(shí)間，否則舍去。

引入的隨機(jī)數(shù)P，便可計(jì)算分支經(jīng)驗(yàn)飽和常數(shù)KS：

菌絲體在生長(zhǎng)的過(guò)程中，分支的生長(zhǎng)隨著自身物質(zhì)的合成、運(yùn)輸逐漸達(dá)到飽和，便會(huì)停止延伸，并產(chǎn)生新的尖端，其生長(zhǎng)過(guò)程滿足飽和動(dòng)力學(xué)方程。

式 (8) 中，ktip為環(huán)境影響常數(shù)，取決于發(fā)酵參數(shù)的變化。結(jié)果表明，該模型能夠很好地預(yù)測(cè)黑曲霉 Aspergillus niger在不同葡萄糖濃度下菌絲體的總長(zhǎng)度以及分支產(chǎn)生的情況。

1.2.3 絲狀真菌宏觀形態(tài)與微觀形態(tài)之間的關(guān)聯(lián)

絲狀真菌微觀形態(tài)的發(fā)展過(guò)程決定了菌絲體最終的宏觀形態(tài)。液體深層發(fā)酵過(guò)程中，根據(jù)絲狀真菌孢子在萌發(fā)早期的聚集特性，可以將其分為聚集型 (Coagulating type) 與非聚集型(Non-coagulating type)。

聚集型的絲狀真菌 (如曲霉屬)，最終宏觀形態(tài)傾向成為菌絲球。對(duì)孢子聚集現(xiàn)象的研究常常需要建立在種群數(shù)量平衡的基礎(chǔ)之上，而由此發(fā)展起來(lái)的模型也可稱(chēng)為種群數(shù)量平衡模型(Population balanced model)。例如，黑曲霉Aspergillus niger在接種后便開(kāi)始出現(xiàn)孢子的聚集現(xiàn)象，孢子的聚集與散開(kāi)處于動(dòng)態(tài)平衡，孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲體對(duì)孢子產(chǎn)生二次吸附，此時(shí)平衡被打破，菌絲體最終形成菌球[18]。也有研究表明，孢子的聚集與否只影響菌球形成時(shí)間的早晚，而不能決定宏觀形態(tài)[19]。

對(duì)于非聚集型的絲狀真菌 (如米根霉)，菌絲體的宏觀形態(tài)表現(xiàn)非常不穩(wěn)定。描述這類(lèi)真菌生長(zhǎng)的模型多以微觀形態(tài)的各項(xiàng)參數(shù)為統(tǒng)計(jì)量。Lejeune的研究認(rèn)為，里氏木霉Trichoderma reesei尖端的延伸速率以及分支的頻率都會(huì)影響到菌球的形成以及菌球的結(jié)構(gòu)[20]。而Liao等則用邏輯回歸模型 (Multiple logistic regression model) 表述了環(huán)境因素的變化對(duì)米根霉菌球形態(tài)的綜合作用[21]。但是，從本質(zhì)上來(lái)講，上述研究都只是對(duì)形態(tài)發(fā)育過(guò)程的描述與預(yù)測(cè)，尚未能深入解釋非聚集類(lèi)型絲狀真菌的微觀形態(tài)與宏觀形態(tài)之間關(guān)聯(lián)的機(jī)理。

2 形態(tài)發(fā)育數(shù)學(xué)模型在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化中的應(yīng)用

2.1 描述菌絲體形態(tài)與產(chǎn)物的模型

絲狀真菌的不同形態(tài)直接影響了氧氣與基質(zhì)的供應(yīng)，進(jìn)而影響基因的全面調(diào)節(jié)及代謝途徑的遷移；例如，黑曲霉Aspergillus niger在呈球狀的形態(tài)時(shí)，傾向于產(chǎn)有機(jī)酸，極少或者不產(chǎn)酶制劑；呈絲狀時(shí)，卻是酶制劑產(chǎn)品的高產(chǎn)形態(tài)[22]。

形態(tài)與產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)還體現(xiàn)在不同部位的菌絲體的生長(zhǎng)代謝存在差異。例如，蛋白質(zhì)通常是在菌絲體尖端分泌的；次級(jí)代謝產(chǎn)物通常與菌絲體的非活性生長(zhǎng)部位有關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道了青霉菌Penicillium chrysogenum菌絲體中分隔形成及空泡程度與青霉素的產(chǎn)量存在關(guān)聯(lián)性[23]。

由于氧在發(fā)酵體系中的低溶解性，質(zhì)量傳遞的限制步驟一般認(rèn)為是氧傳遞限制。根據(jù)雙膜理論，氧傳遞的限制步驟主要發(fā)生在氧分子從邊界層擴(kuò)散到液相主體的過(guò)程中；但是，在絲狀真菌的液體深層發(fā)酵體系中，氧的傳遞還涉及到菌絲球內(nèi)部的擴(kuò)散過(guò)程。Cui認(rèn)為，氧氣在菌球內(nèi)部的傳遞過(guò)程為分子擴(kuò)散，不受液相主體流型影響[24]。Hille等認(rèn)為，受液相主體復(fù)雜流型的影響，單純的分子擴(kuò)散過(guò)程不足以描述菌球內(nèi)部的傳遞，菌球內(nèi)部的結(jié)構(gòu)及質(zhì)量分布對(duì)氧的傳遞具有重要影響[25]。但是共同的觀點(diǎn)都認(rèn)為，當(dāng)菌絲球過(guò)大，氧在內(nèi)部的傳遞是受限的，所以存在一個(gè)理論最大直徑，此時(shí)菌球中心的理論氧濃度為零，該直徑即為菌球的臨界直徑。

采用數(shù)學(xué)模型描述絲狀真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物、形態(tài)及環(huán)境的關(guān)聯(lián)，極大地豐富和發(fā)展了絲狀真菌形態(tài)學(xué)，同時(shí)也提高了發(fā)酵過(guò)程的預(yù)測(cè)控制水平。常見(jiàn)的模型為菌絲體個(gè)體模型(Individual model or cell model)，具體包括非結(jié)構(gòu)化模型與結(jié)構(gòu)化模型。

2.1.1 非結(jié)構(gòu)化模型 (Unstructured model)

非結(jié)構(gòu)化模型是基于微生物反應(yīng)原理，包括底物的運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)以及產(chǎn)物的分泌過(guò)程，同時(shí)基于穩(wěn)態(tài)假設(shè)，將單個(gè)菌絲體或者菌球類(lèi)比成自固化酶，用一系列的控制方程來(lái)探究底物在研究對(duì)象內(nèi)的消耗，以及產(chǎn)物生成過(guò)程的模型。

以菌球生長(zhǎng)形式的發(fā)酵體系為例，質(zhì)量在菌球內(nèi)部的傳遞被認(rèn)為是非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過(guò)程[25]，根據(jù)費(fèi)克第二定律 (Fick’s second law)。在rp處，組分i濃度ci隨時(shí)間的變化率等于該處的擴(kuò)散通量隨距離變化率的負(fù)值與質(zhì)量的消耗速率ri之和。

式 (9) 中Di為i組分在發(fā)酵體系中的有效擴(kuò)散系數(shù)。除了對(duì)發(fā)酵體系中組分變化的認(rèn)識(shí)外，菌體的生物量xi變化情況是非結(jié)構(gòu)化模型關(guān)心的重點(diǎn)。生物量的通量jxi在徑向方向的變化以及整個(gè)過(guò)稱(chēng)中生物量的合成速率決定了整個(gè)生物量的變化與分布。

對(duì)非結(jié)構(gòu)化的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行求解，可以預(yù)測(cè)發(fā)酵體系中各種物質(zhì)的生成，菌體生物量的變化。例如，Rinas等成功運(yùn)用非結(jié)構(gòu)化模型預(yù)測(cè)了黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶 (GOD) 體系中葡萄糖、氧氣、中間代謝物以及產(chǎn)物的關(guān)聯(lián)[26]。非結(jié)構(gòu)化模型針對(duì)的是菌絲體與環(huán)境、產(chǎn)物之間的生長(zhǎng)代謝情況，該模型無(wú)法解析菌絲體在具體結(jié)構(gòu)中的功能分區(qū)，以及形態(tài)的生長(zhǎng)演化過(guò)程；因此，從非結(jié)構(gòu)化模型向結(jié)構(gòu)化模型發(fā)展已成為趨勢(shì)。

2.1.2 結(jié)構(gòu)化模型 (Structured model)

結(jié)構(gòu)化模型是基于菌絲體在功能上的結(jié)構(gòu)分區(qū)或者活性在結(jié)構(gòu)上變化的生理學(xué)基礎(chǔ)，建立的絲狀真菌分化與關(guān)于產(chǎn)物生成的理論模型。結(jié)構(gòu)化模型側(cè)重于解釋形態(tài)分化的內(nèi)在機(jī)理以及形態(tài)分化在功能變化上的表現(xiàn)。

在細(xì)胞的一個(gè)生長(zhǎng)周期中，涉及尖端的生長(zhǎng)、細(xì)胞核的分化、分隔、及分支的形成[27]。 Nielsen認(rèn)為，根據(jù)該周期的復(fù)制情況，菌絲體可以分為 3個(gè)區(qū)域：頂端 (Apical)、次頂端(Subapical) 以及菌絲體 (Hyphal)[28]。而Megee，Thomas等則認(rèn)為，結(jié)構(gòu)分區(qū)應(yīng)該與細(xì)胞的分化和產(chǎn)能相關(guān)聯(lián)[29-31]。以產(chǎn)黃青霉 Penicillium chrysogenum為例，菌絲體的生長(zhǎng)、功能分化以及青霉素產(chǎn)生是一個(gè)高度集成的過(guò)程；青霉素的產(chǎn)生與停止生長(zhǎng)的菌絲體比例密切相關(guān)。在深層發(fā)酵中，可以將菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)分為不同類(lèi)型：A0，活性生長(zhǎng)區(qū)域；A1非活性生長(zhǎng)區(qū)域 (停止生長(zhǎng)區(qū))；A2小空泡區(qū)；A3衰退區(qū)域 (空泡區(qū))與A4自溶區(qū)。根據(jù)其功能的分區(qū)，可以得到如圖3所示的結(jié)構(gòu)化原理圖。

圖3 (A) 青霉菌Penicillium chrysogenum產(chǎn)青霉素結(jié)構(gòu)分化原理圖 (B) 結(jié)構(gòu)分化以及青霉素生產(chǎn)原理圖[31]Fig. 3 (A) A schematic diagram for simple differentiation of Penicillium chrysogenum. (B) Mechanisms for extension, branching, vacuolation, degeneration, autolysis, and penicillin production[31].

在結(jié)構(gòu)化分區(qū)原理圖的基礎(chǔ)上，建立相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型，便可獲得整個(gè)過(guò)程控制的方程。結(jié)構(gòu)化模型在建立方程的過(guò)程中，需要進(jìn)行必要的簡(jiǎn)化處理或者假設(shè)。例如：在菌絲體活性生長(zhǎng)區(qū) (A0) 延伸轉(zhuǎn)化為非活性生長(zhǎng)區(qū) (A1) 的過(guò)程 (Ⅰ) 以及非活性生長(zhǎng)區(qū)分支產(chǎn)生活性生長(zhǎng)區(qū)域 (A0) 的過(guò)程 (Ⅱ) 中，不同的研究者所采用的控制方程會(huì)有所區(qū)別。Birol等認(rèn)為[32]，單純的菌絲體延伸以及分支過(guò)程分別決定于所需底物的數(shù)量關(guān)系以及轉(zhuǎn)化的速率。即：

但是，Paul和Thomas則認(rèn)為，在A1至A0的過(guò)程 (分支形成) 中，還涉及基質(zhì)的消耗；而菌絲體延伸的過(guò)程，不但涉及基質(zhì)的消耗，而且分支形成后也伴隨A0的產(chǎn)生；所建立的方程如下：

借鑒酶催化反應(yīng)中底物與酶結(jié)合的中間過(guò)渡態(tài)，在分化過(guò)程中，假設(shè)了A0至A1的中間過(guò)渡態(tài)A0*。認(rèn)為A0至A0*以及A0*至A0，再?gòu)腁0*至A1的過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡之中?；谶@種過(guò)渡態(tài)假設(shè)，很好地解決了菌絲體分化過(guò)程中，活性生長(zhǎng)部位與非活性生長(zhǎng)部位的區(qū)分問(wèn)題，模型體現(xiàn)了很好的適用性[31]。

應(yīng)當(dāng)指出的是，結(jié)構(gòu)化模型是當(dāng)前功能最為強(qiáng)大、高度發(fā)展且適用性很好的模型；廣泛應(yīng)用于工程實(shí)踐，尤其是在次級(jí)代謝產(chǎn)物以及酶制劑的發(fā)酵控制中。

2.2 描述菌體形態(tài)與環(huán)境流變性變化的模型

絲狀真菌在深層發(fā)酵中，發(fā)酵過(guò)程還伴隨著發(fā)酵液流體特征的改變，在這個(gè)過(guò)程中質(zhì)量傳遞、動(dòng)量傳遞以及流變性均發(fā)生改變。

研究表明，絲狀真菌發(fā)酵形態(tài)會(huì)直接影響發(fā)酵液的流變性能，特別是在高粘度發(fā)酵的時(shí)候[33]。最開(kāi)始的發(fā)酵液一般為牛頓流體，隨著菌絲體的增長(zhǎng)，菌絲體間發(fā)生相互纏繞與粘連，菌絲體生物量的細(xì)微變化即可引起發(fā)酵液粘性的迅速增加，發(fā)酵液在后期表現(xiàn)為非牛頓流體[34]。由于非牛頓流體的假塑性或者脹塑性特性，其粘性不僅受體系中生物量變化的影響，也與流體的流型 (雷諾數(shù) Re) 以及質(zhì)量傳遞傳遞系數(shù) (KLa)密切相關(guān)[35]。

研究發(fā)酵體的流變性是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程。在早期研究形態(tài)與流變性的模型中，都表現(xiàn)為經(jīng)驗(yàn)或者半經(jīng)驗(yàn)的模型，如賓漢模型以及謝赫爾-巴克利模型等等，這些模型的特點(diǎn)是針對(duì)發(fā)酵液體系表觀粘性的研究，并沒(méi)有真正體現(xiàn)菌體形態(tài)與粘性的關(guān)系，其應(yīng)用也存在很大的局限性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)相比生物量，菌體形態(tài) (特別是團(tuán)簇狀菌絲體) 對(duì)流變性具有同樣重要的影響[36]。Thomas等定義了單位重量的生物干重對(duì)流變參數(shù)的數(shù)值為XBDM；研究認(rèn)為，菌體形態(tài)參數(shù)如粗糙度 (Roughness) R與致密度(Compactness) C對(duì)菌體的流變性影響最為顯著[37]，得到菌體形態(tài)與流變性的關(guān)系模型：

不同體系下得到的模型參數(shù)有所差異，但該模型都表現(xiàn)了很好的適用性，成功預(yù)測(cè)了發(fā)酵體系中流變性的變化[35]，為發(fā)酵體系的優(yōu)化提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。

3 工程學(xué)角度優(yōu)化絲狀真菌形態(tài)的策略

在發(fā)酵工業(yè)中，通過(guò)控制絲狀真菌形態(tài)達(dá)到增加產(chǎn)量的目的，是絲狀真菌形態(tài)學(xué)研究的重要目標(biāo)。工程學(xué)角度優(yōu)化控制絲狀真菌形態(tài)是指利用工程學(xué)的原理從發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境以及其他工程學(xué)角度來(lái)控制形態(tài)，達(dá)到優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程的目的。

3.1 優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境控制絲狀真菌形態(tài)

3.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)絲狀真菌形態(tài)控制的影響

根據(jù)微生物生長(zhǎng)的特性，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的成分以及組成，如碳源、氮源、金屬離子的濃度及種類(lèi)，控制絲狀真菌形態(tài)。Nielsen等研究了不同葡萄糖糖濃度下黑曲霉 Aspergillus niger菌絲體的生長(zhǎng)情況，研究發(fā)現(xiàn)在不同糖濃度下，菌絲體的分支情況會(huì)有所區(qū)別[17]。氮源也是影響菌絲體形態(tài)的重要因素，在絲狀真菌的培養(yǎng)中，如果氮源過(guò)于豐富，菌絲體生長(zhǎng)速率過(guò)快，生物量會(huì)急劇增加不受控制，由于發(fā)酵液的流變性是與菌絲體的生物量相關(guān)聯(lián)的，生物量過(guò)大將導(dǎo)致發(fā)酵體系中菌絲體粘連成團(tuán)塊狀，導(dǎo)致發(fā)酵失敗。在實(shí)際生產(chǎn)中，培養(yǎng)基常常是氮源或者磷源限制的[38]。例如，Shi等在利用頂頭孢霉菌Cephalosporins acremonium 發(fā)酵產(chǎn)頭孢菌素 C (CPC) 的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用硫銨—豆油偶聯(lián)型流加策略，將氨態(tài)氮濃度控制在3~6 g/L的范圍，使得細(xì)胞在發(fā)酵中期正常分化為高度膨脹菌絲體，并為發(fā)酵后期利用豆油進(jìn)行CPC的合成奠定基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)了 CPC的高產(chǎn)[39]。常見(jiàn)的必需微量金屬離子，對(duì)菌絲體的形態(tài)發(fā)育是非常重要的。Ca2+離子被證明參與了絲狀真菌菌絲體生長(zhǎng)合成過(guò)程中蛋白質(zhì)激酶的合成，而Na+、K+、Fe2+、Mn2+、Zn2+離子都與菌絲體合成過(guò)程有關(guān)[3]。Liao等則綜合考察了接種孢子濃度，葡萄糖、尿素、磷酸鹽、金屬離子的濃度，發(fā)酵體系pH以及微粒子添加對(duì)米根霉生長(zhǎng)形態(tài)的影響規(guī)律，所建立的模型能很好預(yù)測(cè)環(huán)境變化的因素對(duì)菌球形態(tài)的綜合影響[40]。

3.1.2 發(fā)酵條件對(duì)絲狀真菌形態(tài)控制的影響

發(fā)酵培養(yǎng)條件一般包括接種量、溫度、pH、發(fā)酵液流場(chǎng)情況以及供氧等。實(shí)踐證明，發(fā)酵條件的優(yōu)化是控制絲狀真菌形態(tài)的有效手段。

由于絲狀真菌為多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，假設(shè)菌絲體在發(fā)酵過(guò)程中不被打碎，基于種群的數(shù)量平衡原理，孢子的接種濃度直接決定了其種群的數(shù)量[41]。適合的接種濃度，對(duì)于控制發(fā)酵體系中的生物量以及最佳形態(tài)的獲得都十分重要。

pH對(duì)菌絲體形態(tài)的影響主要表現(xiàn)為孢子的聚集狀態(tài)與環(huán)境pH密切相關(guān)，推測(cè)其機(jī)理是pH與孢子表面帶電特性相關(guān)；不適的pH也會(huì)抑制胞內(nèi)酶的活性、細(xì)胞壁通透性等從而影響菌體生長(zhǎng)。本課題組在研究pH與米根霉形態(tài)關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：pH小于2.1時(shí)，孢子不能萌發(fā)；pH 2.3~2.7時(shí)，形成分散的菌球；pH為2.9時(shí)，形成菌球與絮狀菌絲的混合物；pH大于3.1時(shí)，呈團(tuán)塊狀[42]。綜上情況可以認(rèn)為，低pH對(duì)米根霉的形態(tài)影響主要表現(xiàn)為對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用。根據(jù)這個(gè)原理，我們開(kāi)發(fā)了針對(duì)工業(yè)放大的菌球形態(tài)多級(jí)預(yù)培養(yǎng)技術(shù)[43]。

攪拌是影響絲狀真菌發(fā)酵過(guò)程相當(dāng)重要的因素，也是相對(duì)容易改變的因素。攪拌轉(zhuǎn)速會(huì)影響溫度、質(zhì)量及動(dòng)量的傳遞，攪拌對(duì)菌絲體的物理剪切作用也是引起眾多研究者興趣的課題之一。

發(fā)酵系統(tǒng)是一個(gè)包括固相、液相、氣相的非均相系統(tǒng)，質(zhì)量的傳遞過(guò)程受不同相間湍動(dòng)程度的影響，攪拌則是這種湍動(dòng)的主要?jiǎng)恿?lái)源。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，球狀菌絲體直徑會(huì)變小，變得更加致密，同時(shí)還有破碎菌絲體的存在[44]。研究人員提出了菌球破壞的3種機(jī)理：菌絲球與漩渦之間的相互作用[45]、攪拌槳邊緣或者擋板剪切力與菌絲球的作用以及菌絲球與菌絲球之間的相互沖擊[46]。Cui等的研究發(fā)現(xiàn)，菌絲球表面菌絲體的長(zhǎng)度與反應(yīng)容器中輸入的功率存在關(guān)聯(lián)，即菌絲體長(zhǎng)度正比于單位體積輸入功率ε的0.25次方[47]，以此推斷菌球破壞的機(jī)理是漩渦的剪切作用對(duì)菌絲體做功導(dǎo)致了菌絲體的破壞，其以胡克定律建立的菌絲體破壞機(jī)理模型很好地預(yù)測(cè)了菌球在發(fā)酵體系中的破壞情況。

攪拌還會(huì)改變菌球與液相主體之間邊界層的質(zhì)量傳遞情況。以氧氣的傳遞為例，攪拌轉(zhuǎn)速的增加可以增強(qiáng)氧氣傳遞。在攪拌速度增加的時(shí)候，菌球的致密度會(huì)增加，但是，到底是由于剪切的改變還是由剪切引起的溶氧改變引起了菌球致密度的改變，其結(jié)果待進(jìn)一步深入研究。Cui等在不改變攪拌速度和通氣量的情況下，改變通入反應(yīng)器中氧的比例，將反應(yīng)過(guò)程中的溶氧情況從 5%增加至 330%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單位面積的菌絲體生物量隨著溶氧的增加而增加 (認(rèn)為氧的生長(zhǎng)為生物量的關(guān)鍵基質(zhì))，但是并不受外界攪拌速度的改變影響；由此推斷，在菌球內(nèi)部的傳質(zhì)機(jī)理為分子擴(kuò)散，液相主體的對(duì)流與湍流對(duì)菌球內(nèi)部的傳質(zhì)影響甚微[48]。但是Cui等的解釋中忽略了風(fēng)量的輸入不僅伴隨著氧氣的輸入也伴隨著能量的輸入，即通風(fēng)也會(huì)給發(fā)酵體系輸入能量，最明顯的例子是在氣升式的發(fā)酵罐中，通風(fēng)會(huì)給發(fā)酵體系輸入能量。Lin等則研究了在相同的總功率下，分別改變攪拌功率和通風(fēng)功率對(duì)黑曲霉菌球形態(tài)的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著通風(fēng)輸入功率的增加，菌絲球在直徑上會(huì)明顯減小，在數(shù)量上會(huì)明顯增加，而且偏向于形成致密度不高的小球，非常利于黑曲霉菌株糖化酶的生產(chǎn)[49]。

3.2 微粒子控制絲狀真菌形態(tài)

自 2008年以來(lái)，從工程學(xué)角度，利用微粒子在流場(chǎng)中的作用，通過(guò)調(diào)整所使用微粒子類(lèi)型與微粒子粒徑來(lái)定向控制絲狀真菌的生長(zhǎng)形態(tài)成為新的技術(shù)前沿[50]。

該技術(shù)的適用對(duì)象是針對(duì)趨向自然生長(zhǎng)成球的聚集型菌株，將球狀的菌絲體控制成絲狀的菌絲體；如曲霉屬真菌的絲狀形態(tài)更利于蛋白質(zhì)的合成和分泌，用于酶制劑的生產(chǎn)。該技術(shù)方法的原理為，在孢子早期的聚集階段，由于流場(chǎng)中的微粒子增強(qiáng)了孢子間的剪切或者沖撞作用，破壞了孢子的聚集，導(dǎo)致了菌絲體在發(fā)酵中呈現(xiàn)絲狀的形態(tài)[51]。

常用的微粒子包括硅酸鹽、硅氧化物、金屬鈦氧化物等等；微粒子的粒徑范圍和濃度均可顯著影響菌體形態(tài)。微粒子用于控制絲狀真菌生長(zhǎng)形態(tài)最先報(bào)道于 Kaup等用 Al2O3來(lái)控制海洋真菌 Caldariomyces fumago形態(tài)生產(chǎn)過(guò)氧化物酶(CPO)，添加Al2O3的粒徑達(dá)到42 μm時(shí)候，生物量和分散菌絲體量均顯著增加，酶產(chǎn)量的增加達(dá)1 000 U/mL[52]，但是粒徑超過(guò)500 μm時(shí)卻對(duì)形態(tài)的影響不大。本課題組通過(guò)在合成培養(yǎng)基中添加適量的秸稈稀酸水解液，成功地將米根霉形態(tài)控制成大小均一的球狀；推測(cè)與秸稈酸解液中的微粒子等組分有關(guān)[53]。

4 結(jié)論與展望

絲狀真菌發(fā)酵過(guò)程中的形態(tài)控制一直是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)；生理學(xué)上的極性生長(zhǎng)決定了其多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，雖然在一定程度上從基因?qū)用娼沂玖私z狀真菌尖端延伸以及分支形成的生理學(xué)機(jī)理。但是，由于絲狀真菌形態(tài)發(fā)育受環(huán)境中多因素的影響，單純從基因工程角度來(lái)控制絲狀真菌的宏觀形態(tài)仍然難以實(shí)現(xiàn)。在絲狀真菌形態(tài)發(fā)育研究中，采用數(shù)學(xué)模型描述生長(zhǎng)狀態(tài)與環(huán)境及產(chǎn)物的關(guān)系，極大地豐富和發(fā)展了絲狀真菌形態(tài)學(xué)，并在過(guò)程的描述、診斷與預(yù)測(cè)中發(fā)揮了重要的作用，基于形態(tài)生理學(xué)的數(shù)學(xué)模型展現(xiàn)了其強(qiáng)大功能。絲狀真菌形態(tài)學(xué)在工程中的運(yùn)用則提高了發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率以及生產(chǎn)強(qiáng)度。

以黑曲霉、青霉等為代表的聚集型真菌在形態(tài)發(fā)育動(dòng)力學(xué)及形態(tài)控制與目標(biāo)產(chǎn)量間的關(guān)聯(lián)得到了較深入的研究，而以根霉為代表的孢子非聚集型真菌，由于形態(tài)發(fā)育存在多因素作用導(dǎo)致形態(tài)控制極其復(fù)雜，對(duì)這類(lèi)真菌的發(fā)育動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)化模型研究尚存在難度，是目前亟需解決的難題。

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