楊會(huì)勇，刁勇，林俊生，許瑞安

1 華僑大學(xué)分子藥學(xué)物研究所，福建 泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

近年來(lái)基因治療在人體臨床試驗(yàn)中取得重大成功，標(biāo)志該技術(shù)的有效性和安全性已獲得重大突破[1]，但如何按照病情需要實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，仍然是困擾該領(lǐng)域研究人員的難題[2]。以腎性貧血的基因治療為例[3]，促紅細(xì)胞生成素(EPO) 表達(dá)水平的過(guò)高表達(dá)會(huì)引起紅細(xì)胞過(guò)度增生，從而引起心肌梗塞腦血栓等嚴(yán)重不良反應(yīng)，其危害可能等同甚至大于 EPO基因治療本身帶來(lái)的益處。糖尿病的基因治療，則對(duì)胰島素表達(dá)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和水平均有很高要求[2]。本課題組曾采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件調(diào)節(jié)以重組腺相關(guān)病毒為載體的基因藥物 (rAAV-Ins) 的表達(dá)[4]。小鼠口服rAAV-Ins后，胰島素表達(dá)可以在1年的時(shí)間內(nèi)隨血糖水平而調(diào)整。但遺憾的是，胰島素表達(dá)的高低與血糖水平變化之間有數(shù)小時(shí)的時(shí)滯，無(wú)法真正應(yīng)用于臨床。

長(zhǎng)期以來(lái)，生物體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控一直被認(rèn)為是蛋白的“專利”。蛋白類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)在基因治療臨床前及部分臨床研究中取得了一定的成功[2,5]，但蛋白調(diào)控系統(tǒng)必須將編碼蛋白因子的基因與治療基因一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞，外源蛋白的免疫原性成為臨床應(yīng)用面臨的首要問(wèn)題。另外系統(tǒng)元件體積大、調(diào)節(jié)響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等也是限制其臨床應(yīng)用的主要缺點(diǎn)。多種具有基因表達(dá)調(diào)控功能的RNA元件的發(fā)現(xiàn)再一次挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)分子生物學(xué)中心法則中關(guān)于RNA功能的定義[6]，其中一類是首先在細(xì)菌mRNA的5￠端非編碼區(qū) (5￠UTR) 中發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān) (Riboswitch)。目前發(fā)現(xiàn)的天然核糖開關(guān)均僅由一段35~200 bp的核苷酸序列組成，其結(jié)構(gòu)與蛋白比較如此簡(jiǎn)單，以至于在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為其行使基因調(diào)控的能力非常有限。但深入的研究表明，核糖開關(guān)在基因表達(dá)調(diào)控方面所具有的功能與蛋白相比毫不遜色[7]。核糖開關(guān)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不需要蛋白因子參與，免疫原性??；元件大小在數(shù)百堿基之內(nèi)，構(gòu)成非常簡(jiǎn)單；響應(yīng)配體時(shí)間一般在數(shù)分鐘之內(nèi)，反應(yīng)迅速；核糖開關(guān)位于mRNA之上，發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用，可實(shí)現(xiàn)緊密調(diào)節(jié)[8]。與蛋白調(diào)控系統(tǒng)相比較所表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點(diǎn)，使得核糖開關(guān)自發(fā)現(xiàn)之日起就引起了廣泛關(guān)注，日益深入的研究結(jié)果顯示其可以在代謝物檢測(cè)、新藥研制、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用[9]。

1 重組核糖開關(guān)的構(gòu)建

1.1 簡(jiǎn)化核糖開關(guān)

天然核糖開關(guān)在結(jié)構(gòu)上可分為適體域與表達(dá)平臺(tái)域兩部分，但部分核糖開關(guān)的適體域與表達(dá)平臺(tái)域在結(jié)構(gòu)上合二為一，即簡(jiǎn)化核糖開關(guān)。早在正式提出核糖開關(guān)概念的4年前，Werstuck等就成功組建了一種簡(jiǎn)化核糖開關(guān)[10]。他們將配體為毒性小、可穿透細(xì)胞膜的染料H33258的2種適體 H10和 H19串聯(lián)插入 Lac Z基因的5￠UTR，得到可在哺乳細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的核糖開關(guān)。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入配體后，插入 H10和H19適體序列與配體結(jié)合，阻礙了mRNA翻譯啟動(dòng)，Lac Z基因表達(dá)水平可降低90%。該研究不僅證明采用基因重組技術(shù)創(chuàng)建核糖開關(guān)的可行性，還首次證明主要存在于原核生物的核糖開關(guān)在真核細(xì)胞內(nèi)也可以發(fā)揮作用。

之后不同研究小組陸續(xù)報(bào)道了數(shù)種簡(jiǎn)化核糖開關(guān)的構(gòu)建，但所有的簡(jiǎn)化核糖開關(guān)均表現(xiàn)為抑制型基因調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，簡(jiǎn)化核糖開關(guān)插入 mRNA的位置，決定了其作用機(jī)制是阻斷核糖體43S亞單位與mRNA帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合，還是干擾核糖體對(duì)mRNA掃描[11]，多個(gè)適體結(jié)構(gòu)串聯(lián)應(yīng)用有助于調(diào)節(jié)配體的量效動(dòng)力學(xué)范圍[12]。

1.2 復(fù)雜核糖開關(guān)

與簡(jiǎn)化核糖開關(guān)不同，一個(gè)復(fù)雜核糖開關(guān)中含有相對(duì)獨(dú)立的適體域和表達(dá)平臺(tái)域，兩區(qū)域則由接頭序列相連接。據(jù)研究，復(fù)雜核糖開關(guān)中適體區(qū)域相對(duì)保守，而基因表達(dá)平臺(tái)域則有很大變化，甚至同一個(gè)配體小分子有多個(gè)作用機(jī)制不同的核糖開關(guān)對(duì)應(yīng)[13]。因此，構(gòu)建這類核糖開關(guān)時(shí)，一般是首先獲得高度特異和高親和力結(jié)合配體小分子的適體區(qū)域，然后根據(jù)需要選擇合適的表達(dá)調(diào)控機(jī)理，最后通過(guò)連接元件組裝成完整的核糖開關(guān)。

根據(jù)作用機(jī)理，復(fù)雜核糖開關(guān)可分為轉(zhuǎn)錄終止、翻譯啟動(dòng)和 mRNA剪切等類型。當(dāng)適體域與特定配體結(jié)合后，核糖開關(guān)的構(gòu)象隨之發(fā)生改變，從而影響 mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯起始或前體剪接過(guò)程[14-16]。

1.2.1 轉(zhuǎn)錄終止型復(fù)雜核糖開關(guān)

轉(zhuǎn)錄終止子是一種末端含有 polyU尾巴的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中 polyU尾巴對(duì)終止子的功能至關(guān)重要，但不影響其莖環(huán)折疊。當(dāng)RNA聚合酶進(jìn)行 mRNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，如遭遇轉(zhuǎn)錄終止子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)便從轉(zhuǎn)錄模板脫落，下游序列的轉(zhuǎn)錄隨之終止。轉(zhuǎn)錄終止是天然核糖開關(guān)的常用機(jī)制，數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)串聯(lián)可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的嚴(yán)密調(diào)節(jié)[17]。Fowler等[18]選用茶堿適體TCT8-4組成適體域，以來(lái)源于枯草桿菌的MetI基因轉(zhuǎn)錄終止子為表達(dá)平臺(tái)，從含有抗終止子序列的文庫(kù)中篩選產(chǎn)生接頭序列，嘗試構(gòu)建一種轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)。很遺憾的是，該核糖開關(guān)的最終作用機(jī)制并不是轉(zhuǎn)錄終止，因?yàn)閷⒔K止子的polyU尾序列突變甚至敲除終止子后，其基因調(diào)控作用仍然保留。

1.2.2 翻譯啟動(dòng)型復(fù)雜核糖開關(guān)

核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS) 是位于mRNA上游的特異序列，核糖體通過(guò)識(shí)別并結(jié)合 RBS啟動(dòng)翻譯過(guò)程。在原核生物中該序列稱為SD序列，在真核生物中則稱為Kozak序列。Desai等[19]將茶堿適體插入LacZ報(bào)告基因RBS上游，適體序列與表達(dá)平臺(tái)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)將RBS屏蔽在內(nèi)，阻斷了翻譯啟動(dòng)過(guò)程。當(dāng)加入茶堿后，適體與茶堿結(jié)合形成新的構(gòu)象，將表達(dá)平臺(tái)域中的 RBS暴露在外，有利于核糖體參與的翻譯啟動(dòng)。與大部分天然核糖開關(guān)不同，該核糖開關(guān)表現(xiàn)為激活型基因調(diào)控作用，基因表達(dá)水平呈配體劑量依賴性增加，最大激活指數(shù) (激活后與激活前基因表達(dá)水平的比值) 可達(dá)8倍。因適體域和表達(dá)平臺(tái)間接頭序列的長(zhǎng)度和堿基類別對(duì)激活指數(shù)以及配體的量效動(dòng)力學(xué)范圍均有顯著的影響，采用細(xì)胞內(nèi)篩選法對(duì)接頭序列進(jìn)一步優(yōu)化，可提高激活指數(shù)至36倍[20]。繼續(xù)對(duì)RBS序列同步優(yōu)化，又可以提高激活指數(shù)至96倍[21]。

1.2.3 mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)

在真核生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA前體的可變剪切既可產(chǎn)生功能不同的蛋白，又可以作為基因表達(dá)的有效調(diào)控手段[22]。近年來(lái)相繼在真菌及植物細(xì)胞mRNA的5￠端和3￠端UTR以及編碼區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)的存在，表明 mRNA選擇剪切型核糖開關(guān)能夠在真核細(xì)胞內(nèi)有效發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)節(jié)的作用[23-26]。一般 mRNA前體的一個(gè)有效的剪切部位形成需要包含3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)：5￠端識(shí)別位點(diǎn)、分支序列和3￠端識(shí)別位點(diǎn)。研究表明[27]：當(dāng)剪切識(shí)別位點(diǎn)處于 mRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖結(jié)構(gòu)內(nèi)時(shí)，即被屏蔽而無(wú)法被剪切復(fù)合體識(shí)別，對(duì) mRNA前體內(nèi)含子的剪切過(guò)程也不再啟動(dòng)。mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)利用了這個(gè)特點(diǎn)：通過(guò)結(jié)合配體小分子，使剪切識(shí)別位點(diǎn)所處的莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)境發(fā)生改變，從而啟動(dòng)或阻礙剪切過(guò)程。這也是目前所發(fā)現(xiàn)的真核生物中核糖開關(guān)唯一的調(diào)控機(jī)制。

mRNA前體的剪切過(guò)程分為2個(gè)階段。在第一階段，mRNA前體在5￠剪接位點(diǎn)被剪切，內(nèi)含子在分支序列處形成套索結(jié)構(gòu)，但仍然與第二外顯子連接在一起；在第二階段，第一外顯子最后一個(gè)核苷酸的3￠-羥基親核攻擊內(nèi)含子-第二外顯子套索結(jié)構(gòu)間3￠剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵，從而使兩個(gè)外顯子相互連接，內(nèi)含子以套索結(jié)構(gòu)形式被釋放。Kim 等[28]將茶堿核糖開關(guān)插入到前體mRNA的3￠剪接位點(diǎn)，這種結(jié)構(gòu)可以在剪切過(guò)程的第二個(gè)階段抑制前體 mRNA的剪接?？紤]到在剪切過(guò)程的早期進(jìn)行調(diào)控可能效率更高，Kim等[29]又嘗試將核糖開關(guān)插入到編碼區(qū)的內(nèi)含子中，并將內(nèi)含子的分支序列位于適體域的莖結(jié)構(gòu)內(nèi)，結(jié)果配體引起的核糖開關(guān)構(gòu)象改變形成新的發(fā)夾結(jié)構(gòu)將分支序列屏蔽，從而在第一階段抑制了 mRNA的剪接。適體形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，莖結(jié)構(gòu)的大小及分支序列在適體內(nèi)的位置，對(duì)剪切調(diào)控效率有明顯的影響。更有意思的是，該核糖開關(guān)還可以控制前體 mRNA的選擇性剪接。第一內(nèi)含子的分支序列被屏蔽，導(dǎo)致第二內(nèi)含子的分支序列在第一和第二內(nèi)含子2個(gè)5￠剪接位點(diǎn)間進(jìn)行選擇。第二內(nèi)含子的分支序列如選擇第一內(nèi)含子的5￠剪接位點(diǎn)，則有利于形成不含第二外顯子的mRNA。如果將第一內(nèi)含子的分支序列以及第二內(nèi)含子的5￠剪接位點(diǎn)同時(shí)屏蔽，則有可能進(jìn)一步提高不含第二外顯子的mRNA的形成比例。由于絕大多數(shù)人類基因都會(huì)采用選擇性剪接方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以選擇性剪接核糖開關(guān)可能對(duì)基因治療更為重要。

2 重組核糖開關(guān)的篩選

2.1 適體的體外篩選

核糖開關(guān)的設(shè)計(jì)，首先要確定欲采用的配體。理想的配體應(yīng)該具有可以透過(guò)細(xì)胞膜、細(xì)胞毒性小、胞內(nèi)背景水平低等條件。如要應(yīng)用于基因治療，最好是選擇諸如病情相關(guān)的指標(biāo)性因子等為配體。理論上運(yùn)用配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX) 可篩選得到任何指定配體的適體[30-33]。SELEX體外篩選RNA適體的基本過(guò)程為：首先運(yùn)用化學(xué)合成技術(shù)建立一個(gè)含有核苷酸隨機(jī)序列的單鏈DNA (ssDNA) 文庫(kù)，經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到包含1015條左右不同序列的RNA文庫(kù)。采用物理方法 (如柱層析) 篩選與特定配體結(jié)合的RNA序列。結(jié)合反轉(zhuǎn)錄和PCR方法擴(kuò)增所選擇的RNA序列得到新的dsDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)10~15輪的建庫(kù)、篩選與擴(kuò)增，最后得到RNA序列即為候選適體。對(duì)其中的序列逐一進(jìn)行親和力和特異性的鑒定，符合要求的即確定為適體序列。對(duì)于一個(gè)配體一般可篩選得到數(shù)種序列各異的適體。為了獲得適體核心區(qū)域序列和構(gòu)象，我們開發(fā)了一種基于適體核心區(qū)域保護(hù)的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng) (ARP-PCR) 方法，以便對(duì)SELEX得到的候選適體進(jìn)行精確篩選[32]。將與靶分子結(jié)合的候選適體分子采用Dnase Ⅰ酶進(jìn)行酶切，處于單鏈狀態(tài)的未結(jié)合序列被降解，剩余的與靶分子結(jié)合的序列即為適體區(qū)域核心序列。之后對(duì)適體核心序列進(jìn)行莖環(huán)結(jié)構(gòu)分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)適體核心區(qū)域的精確定位及序列構(gòu)象確認(rèn)。在核糖開關(guān)構(gòu)建過(guò)程中，ARP-PCR方法還可用于檢測(cè)核糖開關(guān)結(jié)合配體小分子前后構(gòu)象變化，提高核糖開關(guān)體外篩選的效率。而目前核糖開關(guān)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析多是應(yīng)用操作復(fù)雜的X-衍射方法[34]。

采用SELEX方法體外篩選的適體，并不一定能保證可作為核糖開關(guān)的有效部件，因體外篩選環(huán)境不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)的折疊條件。另外其文庫(kù)序列一般在1015條以下，最優(yōu)的適體序列或許未被包含在內(nèi)；多輪篩選過(guò)程也比較耗時(shí)。

光學(xué)波段包括可見(jiàn)光(380nm-760 nm)和近紅外(760nm-1200nm)，仿石器材的光譜曲線應(yīng)與真山石相近。

2.2 功能性核糖開關(guān)的細(xì)胞內(nèi)選擇

盡管基于SELEX體外篩選的適體可以成功構(gòu)建簡(jiǎn)單的核糖開關(guān)，但其有效性在一定程度上具有偶然性。經(jīng)SELEX體外篩選得到適體，僅極少部分可以構(gòu)建成在體內(nèi)發(fā)揮作用的功能性核糖開關(guān)[35-36]。Weigand等[37]將50 000種候選適體序列進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)功能篩選，最終得到的最佳序列與SELEX體外篩選所得到的序列大相徑庭，說(shuō)明對(duì)配體的親和力和專屬性僅僅是適體成為核糖開關(guān)的必要條件。

2.2.1 傳統(tǒng)遺傳篩選

遺傳篩選是檢測(cè)細(xì)胞中生物分子功能的最優(yōu)方法，因細(xì)胞的存活與其表現(xiàn)型密切相關(guān)，篩選得到的細(xì)胞一定帶有所需的特質(zhì)。為了保證構(gòu)建的核糖開關(guān)在細(xì)胞內(nèi)仍然具有調(diào)控功能，Desai等率先提出進(jìn)行遺傳篩選的思路[19]。該方法的第一步是建立核糖開關(guān)文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行遺傳特質(zhì)篩選。所采用的適體是經(jīng)體外篩選得到的茶堿適體，基因?yàn)槁让顾匾阴＾D(zhuǎn)移酶。當(dāng)核糖開關(guān)被茶堿激活后，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶得以大量表達(dá)，培養(yǎng)基內(nèi)的氯霉素被降解，大腸桿菌可存活，而不含有活性核糖開關(guān)的大腸桿菌均不能生長(zhǎng)。將篩選出來(lái)的活性核糖開關(guān)與突變體以1∶1 000 000的比例混合，重新轉(zhuǎn)染大腸桿菌后，按照此方法仍然可以成功地將活性核糖開關(guān)挑選出來(lái)，證明了遺傳篩選方法的有效性。

Nomura等則利用雙重遺傳篩選方法對(duì)核糖開關(guān)進(jìn)行優(yōu)化[38]，其采用的核糖開關(guān)為 TPP依賴型，調(diào)控的基因?yàn)閠et A。有效表達(dá)tet A的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素有抗藥性，但對(duì)氯化鎳敏感，而不表達(dá)tet A的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素敏感，但耐受氯化鎳。通過(guò)這種方法，他們從75 000株克隆中成功選擇出優(yōu)化的功能性TPP核糖開關(guān)，激活指數(shù)達(dá) 11倍。將目的基因更換為綠色熒光蛋白等其他基因時(shí)，核糖開關(guān)的表達(dá)調(diào)控作用仍正常發(fā)揮，說(shuō)明該開關(guān)可應(yīng)用于多種基因的表達(dá)調(diào)控。

傳統(tǒng)遺傳篩選方法雖然可以實(shí)現(xiàn)活性核糖開關(guān)的選擇，但這些開關(guān)的背景表達(dá)水平仍較高，核糖開關(guān)的激活指數(shù)也不夠理想。其原因可能是由于文庫(kù)的序列組成仍不夠多樣化，篩選標(biāo)準(zhǔn)是定性而不是定量指標(biāo)，因此需要更新的篩選方法進(jìn)行核糖開關(guān)的優(yōu)化。

2.2.2 高通量遺傳篩選

Lynch等將機(jī)器人輔助篩選技術(shù)應(yīng)用于核糖開關(guān)胞內(nèi)篩選，極大地提高了工作效率[20]。基于接頭序列對(duì)核糖開關(guān)功能有顯著影響的認(rèn)識(shí)，他們建立了由65 000種4~8個(gè)隨機(jī)堿基組成的接頭序列文庫(kù)。將含有接頭序列文庫(kù)的核糖開關(guān)轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，首先在含X-gal但缺乏配體茶堿的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，把不表達(dá)報(bào)告基因LacZ的白色單菌落挑出，然后分別接種于含或不含茶堿的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，比較同一菌落的激活指數(shù)。第一步在無(wú)茶堿的條件下選擇白色單菌落是為了降低背景表達(dá)水平，防止泄露效應(yīng)強(qiáng)的核糖開關(guān)被選擇。第二步是選擇激活指數(shù)高的核糖開關(guān)。在第一步篩選過(guò)程中，雖然99%的菌落是不需要的藍(lán)色菌落，但剩余1%的白色菌落數(shù)量就達(dá)到4 000株之多，所以必須采用機(jī)器人輔助系統(tǒng)才能進(jìn)行有效選擇。

以細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力為選擇標(biāo)準(zhǔn)的篩選方法[39]，較上述機(jī)器人輔助系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，可以很容易地在百萬(wàn)級(jí)文庫(kù)內(nèi)進(jìn)行篩選。該方法使用的基因?yàn)閏heZ基因，其表達(dá)與否可使大腸桿菌的表現(xiàn)型在原地翻滾和平穩(wěn)泳動(dòng)之間轉(zhuǎn)變。在 cheZ基因不表達(dá)的情況下，大腸桿菌在原地翻滾，在半固體瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)不發(fā)生遷移。當(dāng)cheZ基因表達(dá)時(shí)，大腸桿菌獲得平穩(wěn)泳動(dòng)能力，可在培養(yǎng)基內(nèi)遷移。將大腸桿菌接種于半固體培養(yǎng)基中，選擇在無(wú)配體條件下保持在原地，但有加入配體后向周圍遷移的菌落，即可得到含有所需要的核糖開關(guān)的菌落。所篩選得到的核糖開關(guān)可以指導(dǎo)大腸桿菌沿著配體標(biāo)記的T型線路遷移，進(jìn)一步證明了該方法的有效性[40]。該方法僅需要一把標(biāo)尺即可實(shí)現(xiàn)機(jī)器人輔助系統(tǒng)所具有的高通量篩選功能，值得推廣。但其缺點(diǎn)是，cheZ基因的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞陷于培養(yǎng)基內(nèi)部而失去活動(dòng)能力，影響篩選效果。

3 存在問(wèn)題與解決策略

3.1 配體與核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)

天然核糖開關(guān)一般采用代謝產(chǎn)物作為調(diào)節(jié)其功能的配體。如果將重組核糖開關(guān)應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域，天然代謝產(chǎn)物則不是配體的最佳選擇，因人體內(nèi)背景濃度的存在會(huì)干擾目的基因的緊密調(diào)控。生物利用度高、藥理學(xué)活性低、體內(nèi)毒性小的非天然小分子配體應(yīng)當(dāng)成為重組核糖開關(guān)的首選。雖然基于SELEX技術(shù)從理論上可以獲得任何配體的適體，但迄今為止，所獲得的能在生物體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用的適體序列屈指可數(shù)，所用的配體幾乎均局限于茶堿、焦磷酸硫胺素 (TPP) 和新霉素等配體，不符合上述首選配體的條件。

在天然核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，結(jié)合化學(xué)篩選和遺傳篩選的手段，正交選擇非天然小分子配體的重組核糖開關(guān)，不失為解決上述問(wèn)題的可選途徑。腺嘌呤是add A核糖開關(guān)的天然配體，通過(guò)與該核糖開關(guān)內(nèi)4個(gè)特定的尿嘧啶結(jié)合發(fā)揮基因調(diào)控作用[41]。將add A核糖開關(guān)的尿嘧啶定點(diǎn)突變，采用遺傳篩選技術(shù)考察 80種非天然腺嘌呤類似物的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)突變體M6與三聚氰酸二酰胺呈現(xiàn)劑量依賴性調(diào)控關(guān)系，但原配體腺嘌呤則失去了對(duì)M6的調(diào)控能力。與add A核糖開關(guān)相比，M6的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平有所降低，推測(cè)是由于突變引起了轉(zhuǎn)錄子的錯(cuò)誤折疊。對(duì)位于M6的P2莖結(jié)構(gòu)繼續(xù)定點(diǎn)突變，所得到的2種突變體M6’和M6”的基因表達(dá)水平明顯提高，但激活指數(shù)仍維持在M6的同等水平。

3.2 熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)

配體對(duì)核糖開關(guān)的調(diào)控特征常用熱力學(xué)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)。配體結(jié)合前后核糖開關(guān)熱力學(xué)穩(wěn)定性的差異可能是決定其基因調(diào)控能力的關(guān)鍵因素，因配體結(jié)合前后融點(diǎn)差異 (△Tm) 的大小與其基因調(diào)控能力成正比[36]。游離的核糖開關(guān)處于構(gòu)象可變的靈活狀態(tài)，可保證配體與其功能團(tuán)發(fā)生交互作用。當(dāng)配體被包裹在核糖開關(guān)結(jié)合口袋之內(nèi)后，則形成穩(wěn)定的有序結(jié)構(gòu)[42-44]。如果熱力學(xué)性質(zhì)是核糖開關(guān)性能的決定因素，則可以通過(guò)比較配體結(jié)合前后熱力學(xué)常數(shù)，有效預(yù)測(cè)核糖開關(guān)的調(diào)控能力，并進(jìn)一步實(shí)施定向改造。

除熱力學(xué)因素外，動(dòng)力學(xué)也是影響核糖開關(guān)功能的重要因素。對(duì)于有足夠的時(shí)間與它們所處的環(huán)境保持平衡的核糖開關(guān)來(lái)說(shuō)，解離常數(shù) (Kd)值是決定其是否因配體濃度做出反應(yīng)的唯一因素[41]。然而，對(duì)于部分轉(zhuǎn)錄終止型核糖開關(guān)，配體結(jié)合與RNA聚合酶反應(yīng)的速度競(jìng)賽結(jié)果，決定了其發(fā)揮基因調(diào)控能力的高低[45-46]。在形成核糖開關(guān)的適體域后，如果配體結(jié)合速度不夠快，在終止子或反終止子構(gòu)象還未形成之時(shí)，聚合酶就已經(jīng)越過(guò)該段序列繼續(xù)完成 mRNA的合成，調(diào)控即宣告失敗。要成功實(shí)現(xiàn)調(diào)控可能需要胞內(nèi)的配體濃度足夠高，即滿足動(dòng)力學(xué)調(diào)控的條件。這也可能是轉(zhuǎn)錄終止型重組核糖開關(guān)激活指數(shù)低于其他類型的原因之一。

3.3 原核生物與真核生物

核糖開關(guān)能否在哺乳細(xì)胞內(nèi)同樣發(fā)揮基因調(diào)控作用，是探索其在基因治療應(yīng)用前必須要回答的根本問(wèn)題。迄今為止，幾乎所有的核糖開關(guān)均來(lái)自細(xì)菌等原核生物，TPP核糖開關(guān)是唯一在真菌和植物等真核生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)，在哺乳細(xì)胞內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)天然核糖開關(guān)的存在。在生物從低等向高等的進(jìn)化過(guò)程中，蛋白質(zhì)在基因調(diào)控方面似乎占據(jù)了上風(fēng)，低等生物中尚存的核糖開關(guān)被認(rèn)為是基因調(diào)控的活化石。核糖開關(guān)功能發(fā)揮無(wú)需蛋白的參與，對(duì)于復(fù)雜的哺乳細(xì)胞來(lái)說(shuō)，可能因核糖開關(guān)的作用機(jī)制過(guò)于簡(jiǎn)單而將其淘汰。最近Kim等[28]設(shè)計(jì)的mRNA選擇性剪接核糖開關(guān)在Hela細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)mRNA的選擇性剪接，預(yù)示了其在哺乳細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的可能性。Endoh等[47]的研究則表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控型核糖開關(guān)與特定蛋白相互配合，也可以在哺乳細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因調(diào)控作用，提示我們研究思路的適當(dāng)調(diào)整也許會(huì)產(chǎn)生出人意料的結(jié)果。

4 展望

構(gòu)建核糖開關(guān)的關(guān)鍵是建立高效的配體特異性的適體篩選平臺(tái)，獲得適體序列的核心區(qū)域；然后可根據(jù)表達(dá)調(diào)控區(qū)域的非保守性，結(jié)合不同的物種采用相應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以實(shí)現(xiàn)靶基因的快速、高效和特異的調(diào)控，如原核生物多采用轉(zhuǎn)錄終止型和翻譯啟動(dòng)型復(fù)雜核糖開關(guān)；真核生物則多采用 mRNA剪切調(diào)控型復(fù)雜核糖開關(guān)等。組合數(shù)學(xué)建模設(shè)計(jì)在優(yōu)化核糖開關(guān)序列，探索核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系方面也可以發(fā)揮重要作用[48]。在明確核糖開關(guān)作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，依據(jù)生物信息學(xué)和構(gòu)效分析，可進(jìn)一步設(shè)計(jì)通用型的核糖開關(guān)，用于不同組織和細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)調(diào)控；同時(shí)也可以設(shè)計(jì)組織特異性核糖開關(guān)，用于腫瘤等疾病的靶向治療。

核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)再一次改變了人們對(duì) RNA的固有觀念，近 10年的研究初步揭示了其作用機(jī)制的新穎性、多樣性及復(fù)雜性。通過(guò)適體域和表達(dá)平臺(tái)的拼接構(gòu)建可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用的重組核糖開關(guān)的研究思路，現(xiàn)在看來(lái)雖然可行，但距離成功應(yīng)用尚為時(shí)過(guò)早。天然核糖開關(guān)經(jīng)歷了數(shù)十億年的進(jìn)化演變才得以實(shí)現(xiàn)，在對(duì)其機(jī)理的認(rèn)識(shí)仍嫌淺薄的今天，試圖在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用幾周時(shí)間就制備出性能卓越的核糖開關(guān)太過(guò)樂(lè)觀。但是隨著對(duì)其構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理的深入了解，高通量自動(dòng)化體內(nèi)篩選技術(shù)的建立和日益成熟，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等新型手段，及時(shí)調(diào)整研究思路與方法，核糖開關(guān)這一“化石”級(jí)調(diào)控元件一定可以在基因治療的嶄新領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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