王斐

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042）

基質(zhì)中木聚糖酶活力測(cè)定方法的研究進(jìn)展

王斐

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042）

本文綜述了基質(zhì)中酶的提取方法及活力測(cè)定方法，如粘度法、生色底物法、瓊脂糖擴(kuò)散法、酶聯(lián)吸附分析法和目前使用較多的還原糖法，如DNS法和最新涌現(xiàn)的用于微量測(cè)定的MBTH法。并就還原端基法介紹了其具體實(shí)驗(yàn)手段，如試管法、罐法、微孔板法。分析了方法中存在的問題并展望了該方法研究的發(fā)展趨勢(shì)，如安培法和等溫滴定量熱法等。

木聚糖酶；測(cè)定；DNS法；MBTH法；微孔板法

在木聚糖酶的生產(chǎn)、銷售、應(yīng)用等流通鏈中，酶活力是質(zhì)量控制的重要技術(shù)指標(biāo)，而其測(cè)定方法則是決定結(jié)果是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵。根據(jù)木聚糖酶的來源及應(yīng)用，所存在的基質(zhì)包括微生物發(fā)酵液、飼料、食品添加劑、紙漿等?；|(zhì)中酶活力受多種因素影響，如溫度、pH、激活劑、抑制劑等[1]。另外，為提高酶制劑的穩(wěn)定性，無活性載體常被用來將酶進(jìn)行吸附固定，在檢測(cè)時(shí)如何將酶提取出來也較為關(guān)鍵。其測(cè)定方法可按原理不同分為粘度法、瓊脂糖擴(kuò)散法、生色底物法、酶聯(lián)吸附分析法和目前使用較多的還原糖法等。

1 基質(zhì)中酶的提取方法的研究

酶的提取質(zhì)量受提取溶劑、溫度、提取時(shí)間的影響。同一種酶在不同的基質(zhì)環(huán)境中抽提條件也不同。Cosson等[2]在測(cè)飼料中木聚糖酶活力時(shí)用pH4.8的檸檬酸鈉-磷酸鹽緩沖液在室溫下攪拌提取0.5h，離心取上清作為酶提取液。高玲等[3]研究浙江酶、華芬酶、Avizyme-1500三種酶制劑中木聚糖酶的提取，發(fā)現(xiàn)華芬酶、Avizyme-150中最佳抽提條件為0.1mol/L的氯化鈉溶液4℃抽提12h，而浙江酶是蒸餾水4℃提取12h。蘇玉春等[4]采用雙水相法從黑曲霉的發(fā)酵液中提取木聚糖酶，即選用PEG4000提取體系，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，氯化鈉濃度為0，親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相后，酶在兩相中分配不同，來達(dá)到提純目的[4]。

2 基質(zhì)中酶提取液的活力測(cè)定方法

2.1 粘度法

該法是通過測(cè)木聚糖酶對(duì)底物粘度的降解率來衡量酶的活性高低，以阿拉伯木聚糖，水溶性木聚糖衍生物等作為底物[5]。底物粘度可通過測(cè)流量的粘度計(jì)以及振動(dòng)旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)等現(xiàn)代電子設(shè)備，引起的電阻變化被轉(zhuǎn)化為酶活力單位。雖然粘度法比較靈敏，但操作復(fù)雜繁瑣，重復(fù)性差，不能測(cè)定底物的米氏常數(shù)，不常使用。

2.2 瓊脂糖擴(kuò)散法

該法的理論基礎(chǔ)是剛果紅與多糖的顯色反應(yīng)。將木聚糖和瓊脂混合制成凝膠板，在瓊脂板上切開一條鑿，將酶溶液倒入到鑿內(nèi)與底物在適當(dāng)條件下發(fā)生酶水解，水解一段時(shí)間后通過直接測(cè)定水解區(qū)域的直徑來反映酶活力的大小[6]。飼料本身還原糖不與剛果紅發(fā)生反應(yīng)，因此有報(bào)道將其運(yùn)用于飼料中木聚糖酶的活力測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單，雖不受飼料本身還原糖的干擾，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)透明圈的分析較為復(fù)雜，準(zhǔn)確性低于其他非擴(kuò)散法。

2.3 酶聯(lián)吸附分析法

該法是將生物素基-木聚糖底物包被在酶標(biāo)板上，加入木聚糖酶在一定溫度條件下酶解后，洗掉已降解的木聚糖，用堿性磷酸酶抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)于酶標(biāo)板上未被降解的生物素基-木聚糖上，然后，加入堿性磷酸酶的底物(對(duì)硝基苯磷酸酯)進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色的深淺來定量未被降解的木聚糖的量，由此間接地測(cè)定木聚糖酶的活力[7]。該法操作簡(jiǎn)單，成本低，不會(huì)因底物中含有過多還原糖而影響測(cè)定結(jié)果，但是如何針對(duì)該方法提取樣品(消化道食糜和飼料)中的酶以及如何消除樣品中的內(nèi)源底物的干擾等仍有待于解決。

2.4 底物染色法

該法是對(duì)底物進(jìn)行化學(xué)修飾后使其帶有特定的熒光物質(zhì)或染料，在木聚糖酶催化下釋放染料或熒光物質(zhì)，通過釋放于乙醇中的染料或熒光物質(zhì)的多少來反映酶活的大小[8]。可用的染料有雷馬氏亮藍(lán)(Retnazolbrilliant Blue R,RBB)、剛果紅等，熒光材料有2-(2-苯丙噻唑)酚 (2-(2-benzothiazolyl)-phenyl)、4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferyl)、熒光增白劑(Calcofluor)等。目前文獻(xiàn)[9]報(bào)道合成一種較好的熒光底物6,8-difluoro-4-methyl-umbelliferyl β-D-xylobioside(DiFMUX2)，找到了內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶的最佳染色底物為芳基4-硫-β-木糖甘[10]。該類方法操作簡(jiǎn)單，但由于底物制備的特殊性，提高了測(cè)定成本，且該法對(duì)溫度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度及影響染色片段溶解度的因素非常敏感。另外，飼料酶作用的底物是酶的天然底物，不宜采用該法測(cè)活力。

2.5 還原糖法

該法是利用木聚糖經(jīng)酶促水解產(chǎn)生的還原端基被氧化所產(chǎn)生產(chǎn)物的量來計(jì)算酶活力，包括DNS法、MBTH法等。

2.5.1 DNS法

該法是利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)在堿性條件下與木聚糖酶解產(chǎn)物的還原末端反應(yīng)生成橙黃-棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測(cè)定還原糖的量來表示酶活力[11]。該法是目前最常采用的方法之一，所得產(chǎn)物顏色穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾，且測(cè)定精密度高。但該法的靈敏度較低，特別是對(duì)于Km值較大的酶活力測(cè)定情況很難測(cè)得酶解初速度，從而不能準(zhǔn)確的檢測(cè)酶含量極低的飼料等基質(zhì)中的酶活力。

2.5.2 MBTH法

該法同DNS法都屬于還原糖法，原理是3-甲基-2-苯并噻唑酮腙MBTH)首先與酶解液中的還原端基反應(yīng)生成嗪，過量的MBTH被Fe3+氧化成陽離子，再與嗪反應(yīng)生成青藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)，還原端基的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈正比，測(cè)定波長(zhǎng)為630nm或650nm[12]。MBTH法常應(yīng)用于微量甲醛含量的測(cè)定[13]。由于該法靈敏度較高，在木聚糖酶解程度極低的條件下即可測(cè)得酶活力，而水解產(chǎn)物中大分子糖鏈的還原端基不會(huì)因分子量的略微變化而有大的反應(yīng)性改變，即，不同聚合度的同類還原糖，其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同，因此，所得活力測(cè)定數(shù)值不會(huì)象DNS法那樣偏離測(cè)定真值[14]。該法已被應(yīng)用于幾丁質(zhì)酶、溶菌酶的活力測(cè)定[15]，其靈敏度比DNS法高十倍以上。

3 還原糖法中木聚糖酶活力的測(cè)定手段

盡管某些還原糖法在化學(xué)計(jì)量方面也存在問題，但由于操作簡(jiǎn)便且重復(fù)性好，因此被廣泛用于基質(zhì)中多糖水解酶的活力測(cè)定。而其測(cè)定手段又較為多樣化，包括試管體系及微孔板法。

3.1 試管法

又稱終點(diǎn)法，酶解反應(yīng)在試管中進(jìn)行。酶與底物于試管中混合后于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用終止液終止酶解過程。氧化劑與還原產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)后，用分光光度法測(cè)定吸光度值。該法適合于在一定時(shí)間內(nèi)酶解速率不變的活力測(cè)定，但不能進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

3.2 微孔板法

該法主要是用96孔板在恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定并完成數(shù)據(jù)的高通量分析。操作過程中最好使用8道式或12道式微量進(jìn)樣器。該法操作簡(jiǎn)單方便、迅速，試劑用量少，一次可處理大量樣品以實(shí)現(xiàn)高通量分析，從而降低測(cè)定成本，提高測(cè)定效率。如Grishutin等[16]將BCA法采用微孔板體系，進(jìn)行了底物專一性研究。但由于該法對(duì)微孔板品質(zhì)、恒溫振蕩器的溫度均勻性要求較高，因此，其精密度、準(zhǔn)確度稍遜于試管法。

4 其它可能用于木聚糖酶活力測(cè)定的方法

4.1 安培法

該法是利用酶解產(chǎn)物中還原端基在發(fā)生氧化還原反應(yīng)過程中釋放的電子與還原端基的量呈比例關(guān)系的特點(diǎn)來測(cè)得還原端基的量從而得到酶活力的。如在鐵氰化鉀安培法中[17]，酶解產(chǎn)生的還原端基在堿性條件下把還原成電化學(xué)氧化還原活性物，它能被電極上的正電位氧化為，并釋放一個(gè)電子，因此可根據(jù)氧化電流信號(hào)計(jì)算還原糖的含量。

4.2 等溫滴定量熱法

該法適用于Km值較小時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定。其原理是根據(jù)酶催化反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的熱量與底物降解速率成比例的關(guān)系進(jìn)行酶活力測(cè)定的[18]。多糖降解時(shí)所產(chǎn)生的熱量太小，在活力測(cè)定時(shí)可加入多糖氧化酶和過氧化氫酶來放大反應(yīng)焓信號(hào)。此法靈敏度高于還原糖法，但由于酶催化水解產(chǎn)生較少的還原端基，而造成后續(xù)的多糖氧化酶表現(xiàn)較低活性，因此不能準(zhǔn)確測(cè)定表觀摩爾焓變值。

5 結(jié)論

酶是生物活性蛋白質(zhì)，基質(zhì)中酶的活力測(cè)定還受提取劑、提取溫度及提取時(shí)間的影響，基質(zhì)本身也具有能溶于緩沖液的大量雜性物質(zhì)，也會(huì)對(duì)酶活力造成一定損失，使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。由于還原糖法操作簡(jiǎn)單、快捷、便于定量，因此迄今為止仍是木聚糖酶最為常用的活力測(cè)定方法，其測(cè)定手段多樣，可根據(jù)測(cè)定需要選擇不同方法。其中，DNS法在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用最多，但靈敏度較低，所測(cè)活力值往往偏高。MBTH法的靈敏度較高，因而可測(cè)得酶解初速度，受蛋白質(zhì)干擾極小，定量準(zhǔn)確，且特別適合于基質(zhì)中低酶活力的測(cè)定。粘度法和瓊脂擴(kuò)散法雖然操作繁瑣、耗時(shí)、很難準(zhǔn)確定量，但在配料中含有大量還原性物質(zhì)時(shí)，可用于待測(cè)樣品間的活力比較或用于木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選。此外，在還原端基法基礎(chǔ)上應(yīng)用安培法可提高測(cè)定的靈敏度，等溫滴定量熱法的靈敏度高于還原糖法中的所有方法，有望應(yīng)用于含木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)及痕量酶活力測(cè)定。

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2012-04-20