賀華良，賓淑英，廖泓之，吳仲真，林進添

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，外來有害生物預(yù)警與控制研究所，廣東廣州 510225)

硫辛酸(Lipoic acid，LA)亦稱α-硫辛酸，為含硫八碳脂酸，在6，8位上有二硫鍵相連(C6和C8上的氫原子被二硫鍵取代)，是一種類維生素物質(zhì).LA是三羧酸循環(huán)的2個重要酶系——丙酮酸脫氫酶復(fù)合物和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的輔基，在能量代謝中發(fā)揮重要作用［1］.動植物組織中LA通常與蛋白質(zhì)分子以酰胺鍵形式共價結(jié)合［2］，主要是由硫辛酸蛋白連接酶(Lipoate protein ligase，LPL)介導(dǎo)催化以共價鍵的方式將LA連接到一類含有硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白分子上，即硫辛酸修飾(Lipoylation)［3］.在原核生物中也發(fā)現(xiàn)了LPL的同系物.李斯特菌中LPL的同系物已被證實為毒力因子，它的缺失會使得細菌不能從宿主攝取硫辛酸，從而影響細菌的生長和毒力［4］.肺炎鏈球菌的LPL的同系物對其粘附宿主細胞有抑制作用［5］.對豬胰島素的研究發(fā)現(xiàn)，其LPL同系物介導(dǎo)的蛋白硫辛酸修飾提高了胰島素與受體的結(jié)合能力［6］.硫辛酸與殺蟲劑的作用發(fā)揮也有密切聯(lián)系，如砷化物殺蟲劑亞砷酸和2個脫氫酶系的一個輔基——硫辛酸的2個—SH相結(jié)合，從而中斷三羧酸循環(huán)［7］.目前，對于部分被硫辛酸修飾的蛋白分子是否可被砷化物殺蟲劑優(yōu)先識別還不清楚.因此，研究LPL的基因表達及其功能，對于蛋白分子硫辛酸修飾以及砷化物殺蟲劑對該類蛋白的結(jié)合力研究具有一定參考意義.

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)隸屬鞘翅目葉甲科害蟲，可為害多種植物，尤其喜食十字花科植物，已成為十字花科蔬菜生產(chǎn)中最難控制的世界性害蟲之一［8-9］.本研究團隊嘗試從蛋白硫辛酸修飾的角度，在分子水平研究影響黃曲條跳甲生物學(xué)特性的作用因子.本文首先關(guān)注介導(dǎo)蛋白硫辛酸修飾的LPL相應(yīng)基因的cDNA序列及表達情況，為今后研究蛋白硫辛酸修飾，以及硫辛酸修飾與砷化物殺蟲劑或其他新型農(nóng)藥作用發(fā)揮之間的關(guān)系提供寶貴的信息資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲飼養(yǎng)及取樣 黃曲條跳甲交配期雌、雄成蟲由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院昆蟲學(xué)實驗室提供.成蟲采用芥菜Brassica juncea菜葉喂食飼養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的溫度為 28℃、濕度為 75%、光照度為4 000 lx，光暗比14 h光∶10 h暗.黃曲條跳甲的組織取樣過程如下:將3～5頭黃曲條跳甲裝入離心管中，在冰上放置5 min;在解剖鏡載物臺的載玻片上滴1滴冰上預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 8.0)，將休克的黃曲條跳甲置于液滴中;在黃曲條跳甲即將蘇醒時快速解剖，分別收集觸角、頭(去除觸角)、中腸、精巢、卵巢、前足、中足、后足等組織樣品，雌蟲和雄蟲的組織樣本分開.樣品收集時先在1.5 mL離心管中放入磷酸鹽緩沖液，待解剖收集滿10頭時，4 000 r/min離心2 min，除去各組織樣本中的磷酸鹽緩沖液，置液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中，備用;各組織器官RNA總量的提取需要解剖80頭以上的雌蟲或雄蟲.

1.1.2 分子生物學(xué)試劑 RNeasy? Plus Mini Kit購置Qiagen公司;Taq DNA聚合酶，PrimeScript?RT reagent Kit，DNA Fragment Purification Kit，MineBest Plasmid Purification Kit，pMD? 18-T，SYBR? Premix Ex TaqTM，500 bp DNA Ladder Marker，DL2 000 DNA Marker，均購自TaKaRa公司.

1.2 黃曲條跳甲RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)使用說明提取黃曲條跳甲不同組織的總RNA.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后，按照PrimeScript?RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)說明書以隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此作為PCR和熒光定量PCR模板.

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)黃曲條跳甲轉(zhuǎn)錄組測序獲得的黃曲條跳甲lpl基因(Pslpl基因)序列(JQ278008)，設(shè)計和篩選符合要求的特異性引物Pslpl-F、Pslpl-R用于后續(xù)的實時熒光定量PCR反應(yīng).同時本研究以黃曲條跳甲的actin基因作為內(nèi)參基因(引物為Ps-actin-F和Ps-actin-R).熒光定量所用引物序列如下，Pslpl-F:TGAAAGCCGTAGGATGGGAATA;Pslpl-R:CTGGGAACCAATCGTCTGTAGG;PCR產(chǎn)物長度為123 bp.內(nèi)參actin基因的PCR擴增引物如下，Ps-actin-F:TAAACCCGACGAAAGCAATGT;Ps-actin-R:CGATTCCGAGAAAAGAACAGG;PCR產(chǎn)物長度為220 bp.

1.4 普通PCR擴增及熒光定量PCR

在離心管中加入以黃曲條跳甲成蟲總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA(約1μg/μL)為模板1μL，再加入10×Ex Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2μL(含Mg2+)、正向和反向引物各 1μL(10 mol/L)，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，加水至 20 μL，混勻離心后放入PCR儀擴增.PCR反應(yīng)程序為:94℃變性3 min;接著進行35個循環(huán)，循環(huán)條件為94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s;循環(huán)完畢后，72℃保溫10 min.擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段.回收產(chǎn)物純化后連接到pMD-18載體，進一步轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍白斑和氨芐篩選，重組質(zhì)粒經(jīng)擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA用于檢測及后續(xù)的熒光定量PCR.測序工作由廣州英駿生物技術(shù)有限公司完成.

熒光定量 PCR采用 SYBR Green染料法，在LightCycler 480熒光PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析.根據(jù)SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書，按20 μL的總反應(yīng)體系(SYBR? Premix Ex TaqTM2×Buffer 10μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，雙蒸水7.4μL，cDNA模板1μL)，采用二步法進行，程序具體的參數(shù)設(shè)置如下:預(yù)變性，95℃ 5 min;擴增，95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán);融解度分析，95℃ 30 s，65℃ 15 s;冷卻，40℃ 1 s.試驗樣本的反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)合下文的標準曲線進行基因表達的絕對定量分析.

1.5 標準曲線的建立及定量分析

分別以actin基因經(jīng)測序驗證的陽性重組質(zhì)粒pMD-Ps-jhip-1為模板，經(jīng)10倍系列稀釋成7個質(zhì)量濃度梯度(5.0、5.0 × 10-1、5.0 × 10-2、5.0 × 10-3、5.0×10-4、5.0 ×10-5和 5.0 ×10-6ng/μL)以優(yōu)化的反應(yīng)條件進行Real-time PCR，重復(fù)3次，以達到熒光的閾值(Ct值)為橫坐標，以稀釋倍數(shù)的對數(shù)為縱坐標建立標準曲線.分析3個標準曲線內(nèi)部的標準差，檢驗試驗的可重復(fù)性.分別根據(jù)標準曲線計算出每次試驗樣本中目標基因的絕對定量.黃曲條跳甲各部位基因相對表達量=Pslpl基因的絕對定量/Ps-actin基因的絕對定量.

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

序列和數(shù)據(jù)搜索使用NCBI上的Blast在線程序;蛋白質(zhì)序列分析采用ExPASy在線ScanProsite程序;蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和等電點分析采用http:∥www.expasy.org/tools/pi-tool.html在線工具;分泌蛋白信號肽序列預(yù)測采用http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在線程序進行;線粒體定位分析采用MitoProt v1.101在線軟件(http:∥ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html);跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測采用TMHMM 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線程序進行.

從NCBI上下載Pslpl基因的同源基因蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列，使用Clustalx1.8軟件對這些序列進行比對，輸出后綴為*.phy格式的文件，采用分子進化遺傳分析軟件PHYLIP3.68進行遺傳距離分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

應(yīng)用高通量測序平臺Illumina's Solexa Genome Analyzer II對交配期的黃曲條跳甲雌、雄成蟲混合樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，采用Soap denovo軟件將每一個讀取序列片段(Read)聚類拼接成單獨基因(Unigene)，再結(jié)合生物信息學(xué)軟件進行靶標序列cDNA全長的判定［10］.本文成功克隆鑒定到含完整開放閱讀框的 Pslpl基因的 cDNA(Genbank登錄號:JQ278008)，cDNA序列總長度為1 641 bp，開放閱讀框為1 182 bp，編碼393個氨基酸.ExPASy在線預(yù)測其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為44 650.92，其蛋白序列的理論等電點為7.62.TMHMM 2.0在線預(yù)測也沒有發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域;SignalP 4.0在線軟件分析沒有發(fā)現(xiàn)典型的分泌蛋白信號肽區(qū)段.但根據(jù)MitoProt v1.101分析表明，該蛋白分子的前13個氨基酸為線粒體信號肽(Mitochondrial targeting sequences，MTS)，定位于線粒體的概率為99.21%.

2.2 Pslpl基因蛋白序列與同源基因蛋白序列相似

性及進化分析

黃曲條跳甲lpl基因(Pslpl基因)的推測蛋白產(chǎn)物(Ps_LPL)與其他5種不同昆蟲(分別屬于鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、雙翅目和同翅目)的LPL蛋白序列的相似性分析見表1.從表1可以看出，Pslpl基因蛋白產(chǎn)物與同屬鞘翅目的赤擬谷盜的LPL蛋白的相似性最高，達67%;而與同翅目昆蟲蚜蟲的相似性偏低，相同的氨基酸數(shù)目也少得多.上述6種昆蟲LPL序列中相同氨基酸的具體分布位置見圖1.

表1 黃曲條跳甲與其他5種昆蟲LPL同源蛋白的相似性分析1)Tab.1 Sim ilarity analysis between Ps_LPL and other hom ologous p roteins from 5 different insects

另外，在其他昆蟲、細菌及脊椎動物等物種中也可找到Pslpl基因的同源基因.從圖2中可以看出，細菌類、脊椎動物的LPL都各自聚類為一支;黃曲條跳甲的LPL(圖2中I1)明顯與其他昆蟲的同源基因蛋白產(chǎn)物聚為一大支.圖2中涉及的無脊椎動物主要涉及昆蟲綱的幾個目，包括:膜翅目的麗蠅蛹集金小蜂、美洲本土熊蜂、歐洲熊蜂、蜜蜂、印度跳蟻、切葉蟻和佛羅里達弓背蟻;雙翅目的致倦庫蚊、埃及伊蚊、岡比亞按蚊和黑腹果蠅;鞘翅目的赤擬谷盜;鱗翅目的帝王斑蝶;同翅目的豌豆蚜.相對來說，在膜翅目昆蟲和雙翅目昆蟲中已報道的lpl基因的同源基因較多，而在鞘翅目中目前只在赤擬谷盜中報道了lpl同源基因.因此，黃曲條跳甲中l(wèi)pl基因的鑒定，為研究昆蟲的蛋白分子硫辛酸修飾提供了更有利和豐富的信息資源.

圖1 6種昆蟲LPL序列之間相同氨基酸的具體分布位置Fig.1 Location of identify amino acids of LPL between six different insects

2.3 Pslpl基因表達分析

參考賀華良等［10］前期的黃曲條跳甲轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，Pslpl基因cDNA的計算表達量為6.47拷貝數(shù).結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整體分析結(jié)果表明，mRNA表達量在5.0～9.9拷貝數(shù)的基因數(shù)量占黃曲條跳甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總和的29.5%.因此，Pslpl基因?qū)儆诩毎谐Ｒ?guī)性表達基因類群的可能性較高.本文主要對Pslpl基因在不同組織中的表達量進行了分析.由圖3可見，Pslpl基因的mRNA在黃曲條跳甲雌、雄成蟲的不同組織器官中都有表達，且表現(xiàn)出一定的特點:1)雌、雄成蟲各組織器官之間表達量相比發(fā)現(xiàn)，頭部和中腸的表達量相對較高，而觸角、前足、中足和后足的表達量相對較低.另外，雄蟲睪丸中Pslpl基因的表達量比雄蟲中腸的表達量要高，而雌蟲卵巢Pslpl基因的表達量則低于其中腸的表達量.2)雌、雄成蟲之間對比分析發(fā)現(xiàn)，除睪丸外，雄蟲的其他組織器官Pslpl基因的表達量均比雌蟲對應(yīng)的組織器官中的表達量要低.熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析表明，雄蟲睪丸中Pslpl基因的表達量為雌蟲卵巢中Pslpl表達量的2.5倍.

圖3 黃曲條跳甲成蟲不同組織中Pslpl基因mRNA的表達量Fig.3 mRNA relative levels in different tissues of adults of Phyllotreta striolata

3 討論

對于LA，早先主要關(guān)注其作為輔酶所發(fā)揮的作用，到1990年以來，研究人員逐步發(fā)現(xiàn)LA具有強大的抗氧化能力、螯合重金屬的能力以及再生其他抗氧化劑的能力.最近，研究還發(fā)現(xiàn)LA能起到延緩衰老的作用［11-12］.動植物組織中LA通常與蛋白質(zhì)分子共價結(jié)合，以酰胺鍵的形式存在［2］.LPL對于LA在細胞中的存在狀態(tài)及功能發(fā)揮可能起到了非常關(guān)鍵的作用.因此，Pslpl基因序列的鑒定及分析，對于在分子水平研究黃曲條跳甲不同組織器官內(nèi)蛋白硫辛酸修飾具有促進作用.

LA含量最高的植物是菠菜，其次是番茄和甘藍.有研究推測，人體LPL同系物蛋白可能能夠?qū)⑼庠?例如食物)提供的LA直接連接到需要硫辛?；牡鞍踪|(zhì)上，從而不受體內(nèi)LA合成途徑的限制［13］.甘藍、芥菜和白菜等十字花科蔬菜是黃曲條跳甲的自然寄主，但目前寄主蔬菜的LA與黃曲條跳甲的蛋白硫辛酸修飾是否具有關(guān)聯(lián)還不確定.因此，Pslpl基因的鑒定有助于研究寄主蔬菜LA含量變化和黃曲條跳甲蛋白硫辛酸修飾水平之間的關(guān)系.

有研究報道，在脊椎動物體內(nèi)肝臟和腎臟組織中LA含量最高［2］，但沒有相關(guān)研究分析與其相關(guān)的LPL表達是否也在肝臟和腎臟中最高.本文對黃曲條跳甲Pslpl基因的表達譜研究發(fā)現(xiàn)，雌蟲Pslpl基因在頭部和中腸的表達量相對較高，而雄蟲除在頭部和中腸表達量較高外，其睪丸中的表達量也較高，初步推測與黃曲條跳甲精子發(fā)生相關(guān)的蛋白硫辛酸修飾需求相對較高.因此，結(jié)合LPL的功能，了解黃曲條跳甲生殖系統(tǒng)硫辛酸修飾的變化，深入探索對精子發(fā)生具關(guān)鍵作用的影響因子，可為黃曲條跳甲綜合防治新策略研發(fā)提供新的思路.

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【責(zé)任編輯周志紅】