葉思特，郭麗瓊，，劉曉蓉，，陳曉陽，林俊芳，

(1華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642;2華南農業(yè)大學生物質能研究所，廣東廣州 510642)

全球石化資源日益枯竭，國際油價強勢上漲，生態(tài)環(huán)境日漸惡化，多渠道開發(fā)可再生油脂資源受到重視.生物柴油是性能優(yōu)良、可直接替代化石柴油的生物燃料產品［1-2］，其主要化學成分是長鏈脂肪酸(甲)酯.目前，大多以動植物油脂為原料經過酯交換反應來生產.但由于動植物油脂資源非常有限，且原料成本極高，因而限制了生物柴油產業(yè)的發(fā)展.科研人員長期探索和研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)微生物能將碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂在菌體內轉化為油脂，因此利用微生物生產油脂是一條開發(fā)新油源的好途徑［3-5］.Ratledge 等［6］把油脂積累量超過細胞總量20%的微生物定義為產油微生物(Oleaginousmicro-organisms).已知的產油微生物包括細菌、酵母菌、霉菌和微藻［7］，其中酵母菌和霉菌類真核微生物積累的油脂具有與常規(guī)植物油更相似的脂肪酸，如菜籽油、棕櫚油和大豆油等，并且富含飽和及低度不飽和的長鏈脂肪酸，是生產生物柴油的潛在原料.后來，關于微生物油脂的研究主要集中于獲取功能性油脂，如富含多不飽和脂肪酸的油脂［8］.近來人們意識到通過微生物生產油脂及相關脂肪酸代謝衍生物，對生物柴油產業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生物質資源利用具有重要意義［9］.在國內外眾多微生物發(fā)酵產油的研究中，粘紅酵母Rhodotorula glutinis所產油脂含量最高，達到72%［6］;油脂含量超過25%的霉菌約有64種，很多霉菌油脂含量在20% ～25%［10］.這些產油微生物發(fā)酵使用的碳源主要是葡萄糖、淀粉、甘油及谷類等，生產成本高.因此，針對生物柴油的微生物油脂生產技術，需要研究來源廣泛、成分穩(wěn)定、價格低廉的油脂發(fā)酵原料.本試驗篩選到4株產油酵母和9株產油霉菌，并對其中1株酵母所產油脂的脂肪酸組成進行了初步分析，以期為下一步產油工程菌株的構建、廢棄木質纖維素的高效利用、微生物油脂的工業(yè)化生產奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

泥土采自湛江、石油平臺污泥、華南農業(yè)大學樹木園、南京紫荊山、河南漯河、中山植物園.采集時，先用小鏟除去表土，取離地表5～15 cm處的泥土，裝入聚乙烯袋中，樣品保存于0℃的保溫瓶中備用.

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

①蘇丹黑B、甲醇、氯仿等試劑購自上?；瘜W試劑廠.②酵母富集培養(yǎng)基:甘油100 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母粉0.2 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌20 min.③酵母篩選培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20 g/L，臨用前加入20 mL預先滅菌的去氧膽酸鈉溶液和3.3 mL鏈霉素溶液(10 000 U/mL)，pH 6.0～6.5，121℃滅菌20 min.④酵母菌種保藏培養(yǎng)基:麥芽汁(10°Bx)100 mL，瓊脂2 g，pH自然(約6.4).⑤霉菌篩選培養(yǎng)基:采用PDA培養(yǎng)基，臨用前在1 000 mL無菌培養(yǎng)基中加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素.⑥產油微生物的初篩培養(yǎng)基采用限氮培養(yǎng)基:葡萄糖 40 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO47 g/L，NaH2PO42 g/L，酵母粉 1 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L.

1.3 產油酵母的篩選

1.3.1 酵母的富集培養(yǎng) 取土壤樣品30份，每份稱取25 g，置于225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成土壤懸液;無菌操作，分別吸取10 mL溶液接入90 mL富集培養(yǎng)液中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，分別吸取1 mL菌懸液轉接到99 mL新鮮富集培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)2～3代.

1.3.2 酵母的分離純化 準確移取100μL培養(yǎng)了2～3代的富集培養(yǎng)液，涂布于酵母篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～4 d，挑取平板上菌落形態(tài)有差異的單菌落進行劃線分離純化，獲得的純菌株轉接到麥芽汁斜面，編號保存.

1.3.3 產油酵母的初篩 將分離純化的酵母接入限氮培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)3 d，取1滴菌液于載玻片上，涂片、加熱固定，用蘇丹黑B染色10～15 min后，傾去染料并用濾紙吸干，再用二甲苯沖洗至無色，最后用w為0.5%的沙黃復染1～2 min，水洗吸干.顯微鏡下觀察，脂類能被染成藍黑色［11］.菌株用PDA斜面編號保存.

1.4 產油霉菌的篩選

1.4.1 霉菌的分離純化 取土壤樣品30份，每份取25 g加入225 mL無菌生理鹽水中，搖勻，制成土壤懸液;無菌吸取100μL接到平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5～7 d后，挑取平板上菌落顏色有差異的單菌落進行劃線分離純化，獲得的純菌株轉接到PDA斜面，編號保存.

1.4.2 產油霉菌的初篩 將分離純化的菌株接入限氮培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)5 d，菌絲用濾紙過濾，輕壓風干，浸泡于蘇丹黑B染液中10 min，再用φ為95%酒精漂洗，致使濾紙呈白色，觀察菌體，帶有藍黑色則含有脂質物質［12］.菌種用PDA斜面編號保存.

1.5 產油微生物的初步鑒定

1.5.1 總DNA提取 參考王藝紅［13］的FEDB法.1.5.2 5.8S rDNA PCR擴增 分別使用ITS1、ITS4 2種通用引物進行PCR擴增，引物序列為:ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC.反應條件為:94℃ 5 min;按94℃ 40 s，53～49℃ 40 s，72℃ 90 s進行30次循環(huán);72℃ 7 min;4℃保存.PCR產物由生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定，得到的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上進行 blast，并使用遺傳進化樹做分析，從而初步鑒定菌株.

1.6 油脂的提取

1.6.1 酸熱法破碎細胞 產油微生物通過限氮培養(yǎng)法獲得的發(fā)酵液在常溫、5 000 r/min下離心6 min，收集菌體到50 mL離心管中.在離心管中加入4 mol/L的鹽酸10 mL，浸泡過夜，沸水浴15～20 min.1.6.2 甲醇-氯仿法抽提油脂 在酸熱法破碎所得液體冷卻后加入10 mL甲醇和10 mL氯仿，充分振蕩后離心，取氯仿層，加入等體積w為0.1%的氯化鈉溶液，混勻，離心，去氯仿層，真空旋轉蒸發(fā)即得油脂.

1.6.3 產油率計算 產油率=油脂質量/菌體干質量×100%.

1.7 油脂成分的分析

選取產油率最高的菌株，采用限氮培養(yǎng)法，發(fā)酵液pH始終維持6.5，于28℃、180 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)7 d后，提取油脂.油脂先經甲酯化前處理，再用氣相色譜-質譜聯(lián)用(Gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)分析測定各成分及含量.

2 結果與分析

2.1 產油微生物的初篩

2.1.1 產油酵母的粗篩 酵母菌經過限氮培養(yǎng)后，取菌液進行蘇丹黑B染色并在顯微鏡下觀察，結果見圖1.酵母細胞內呈現(xiàn)明顯的黑色斑，說明該酵母細胞已有脂肪積累.這是因為酵母積累油脂后其胞內存在的脂肪體可被蘇丹黑B染色，在光學顯微鏡下可清晰地觀測到.根據這個原理可利用鏡檢法對酵母油脂積累表型進行快速初篩，本研究篩選出4株產油酵母，分別編號為 J2-2A、J2-2B、J3-2A、J3-2B.

2.2 產油微生物的相似性比對

圖1 J2-2A菌株細胞蘇丹黑B染色后的顯微照片F(xiàn)ig.1 Micrograph of yeast J2-2A stained by Sudan Black B

2.1.2 產油霉菌的初篩 由于霉菌菌絲體發(fā)達，光學顯微鏡制片過程繁瑣，且不便于限氮發(fā)酵培養(yǎng)，而濾紙能吸附受擠壓菌體的油脂，因而采用濾紙法對篩選霉菌菌絲進行蘇丹黑B染色，結果見圖2.

圖2 M2B菌株細胞的蘇丹黑B染色圖Fig.2 Picture ofmould M2B stained by Sudan Black B

菌體經過蘇丹黑B染色后呈現(xiàn)藍黑色，油脂含量越多，染色越深，說明供試霉菌經過限氮培養(yǎng)后菌絲細胞中有脂肪積累.依此法，本研究篩選獲得了9株產脂肪的霉菌，分別編號為 M1C、M2B、M2C、M2E、M3C、M4C、M5A、M5B、M5D.

使用ITS(Internally transcribed spacer)法對產油微生物進行相似性比對，結果見表1.

表1 產油酵母和產油霉菌相似性比對結果Tab.1 Results of oleaginous yeasts and oleaginousmoulds by blast

2.3 產油率的測定

把獲得的初篩菌株進一步經過限氮擴大培養(yǎng)，收集菌體并通過酸熱法、甲醇氯仿法抽提獲得油脂，計算其產油率，結果見表2.

表2 產油酵母和產油霉菌的產油率Tab.2 Lipid yields of oleaginous yeasts and oleaginous moulds

由表1可知，所有初篩的菌株均可產油，表明初篩方法準確可行.霉菌的產油率在17% ～27%，其中產油最高的菌株為M2B，產油率達到26.4%;酵母的產油率在17% ～45%，其中菌株J2-2B的產油率最高，達44.3%.所以選擇酵母菌株J2-2B用于后期發(fā)酵生產、油脂鑒定試驗.

2.4 油脂成分的測定

菌株J2-2B發(fā)酵所得油脂經過GC-MS分析，其成分及質量比見表3.

表3 產油酵母J2-2B的油脂成分及質量比分析Tab.3 Lipid analysis data of yeast J2-2B

由表3可知，油脂的主要成分為C14～C20脂肪酸，其中C16脂肪酸(棕櫚酸)和C18脂肪酸(油酸)質量比較高，分別為17.21%和54.04%.

3 討論與結論

目前關于產油微生物的篩選方法很多［4，14-15］，但是實際操作復雜、繁瑣.本試驗研究出一套操作簡易、效果優(yōu)良的產油微生物篩選體系與方法:選用以甘油為唯一碳源的富集培養(yǎng)，能有效排除雜菌、大量保留和富集酵母菌，再配合鏈霉素以及脫氧膽酸鈉的復合篩選，從而快速初篩出產油酵母;對于產油霉菌的篩選，采用濾紙碾壓的方法對霉菌染色，簡單、便捷而有效，避開了霉菌用光學顯微鏡觀察時制片過程中的繁雜手續(xù).

本研究篩選出一株高油脂菌株假絲孢酵母，產油率高達44.3%;其他菌株的產油率大多為17%～27%，文獻報道的產油率大多為 20% ～25%［1，4］，本試驗與前人研究結果基本一致.這為下一步高產油菌株的改造、產油發(fā)酵條件的研究提供了理論基礎.

劉淑君等［16］以廢糖液為碳源，用Lipomyces starkey發(fā)酵得菌體油脂質量比為53.6%，其油脂的脂肪酸組成主要有軟脂酸、油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸.本試驗中，假絲孢酵母發(fā)酵所產的油脂成分與已報道的比較一致，即主要為C16和C18脂肪酸，其總質量比占 70%以上，其中油酸質量比最高，達54.04%;棕櫚酸次之，為17.21%.

試驗過程中，產油微生物的細胞破碎-油脂提取采用酸熱法和甲醇氯仿法，此法具有操作簡單、細胞破碎完全、提取速度快、得油率高等優(yōu)點，但是一次性批量生產的量少，鹽酸、甲醇和氯仿等試劑的消耗量大，導致提取成本高、環(huán)境污染大，因此，提取工藝的改進還有待深入研究.

［1］TYSON K S.Biodiesel research progress 1992-1997:NREL/TP-580-24443［R/OL］∥ National Renewable Energy Laboratory.NREL technical report.Denver West Parkway Golden:NREL，1998［2010-11-22］.http:∥www.nrel.gov/docs/legosti/fy98/24433.pdf.

［2］郭平銀，肖愛軍，鄭現(xiàn)和，等.能源植物的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景［J］.山東農業(yè)科學，2007，4:126-129.

［3］EVANSC T，SCRAGG A H，RATLEDGE C.Regulation of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and nonoleaginous yeasts by adenine nucleotides［J］.Eur JBiochem，1983，132(3):609-615.

［4］BOTHAM P A，RATLEDGE C.A biochemical explanation for lipid accumulation in Candida 107 and other oleaginous micro-organisms［J］.Microbiology，1979，114(2):361-375.

［5］PALMIERIL，PALMIERI F，RUNSWICK M J，et al.I-dentification by bacterial expression and functional reconstitution of the yeast genomic sequence encoding themitochondrial dicarboxylate carrier protein［J］.FEBSLetters，1996，399(3):299-302.

［6］RATLEDGE C，WYNN JP.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms［J］.Adv Appl Microbiol，2002，51:1-51.

［7］RATLEDGE C.Lipid biotechnology:A wonderland for the microbial physiologist［J］.JAm Oil Chen Soc，1987，64(12):1647-1656.

［8］COHEN Z，RATLEDGE C.Single Cell Oils［M］.Champaign:AOCSPress，2005:1-20.

［9］趙宗保.加快微生物油脂研究為生物柴油產業(yè)提供廉價原料［J］.中國生物工程雜志，2005，25(2):8-11.

［10］朱丹實，劉賀，呂艷芳.產油脂霉菌的研究進展［J］.糧油加工，2009(6):54-57.

［11］周德慶.微生物學實驗手冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1983:32-34.，:，

［12］楊虹，林娟，歐陽瑞珍.產油微生物的培養(yǎng)［J］.福州大學學報，1997，25(5):103-106.

［13］王藝紅.食用菌DNA提取方法研究［J］.食用菌，2008，30(3):18-20.

［14］THAKUR M S，PRAPULLA SG，KARANTH N G.Estimation of intracellular lipid by the measurement of absorbance of yeast cells stained with Sudan Black B［J］.Enzyme Microb Technol，1989，11(4):252-254.

［15］BLIGH EG，DYERW J.A rapidmethod of total lipid extraction and purification［J］.Can J Biochem Physiol，1959，37:911-917.

［16］劉淑君，楊文博，施安輝.酵母菌HL的批次發(fā)酵及發(fā)酵動力學初探［J］.微生物學通報，2000，27(1):8-11.

【責任編輯 李曉卉】