趙景潤，任曉燕，李復(fù)領(lǐng)，謝佳平

聊城市人民醫(yī)院 1．消化內(nèi)科;2．中心實(shí)驗室，山東聊城252000

胃潰瘍是消化內(nèi)科的常見病，隨著質(zhì)子泵抑制劑及根除幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)治療的應(yīng)用，其治療有了很大的進(jìn)步，但仍有部分患者出現(xiàn)潰瘍的復(fù)發(fā)及難治性潰瘍，研究潰瘍的愈合機(jī)制，對這一部分患者的治療尤為重要。潰瘍的愈合包括上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化等一系列細(xì)胞—基質(zhì)的相互作用，而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其組織抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)在上皮細(xì)胞的再生、傷口的愈合中發(fā)揮重要作用，但在胃潰瘍中的作用研究較少，本研究針對MMP-9和TIMP-1在胃潰瘍組織中的表達(dá)情況及其與組織病理學(xué)間的關(guān)系進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1．1 病例資料 2010年1月～2010年10月我院胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)的活動期胃潰瘍患者50例作為實(shí)驗組，其中男28例，女22例，年齡(47．3±14．3)歲，對照組為我院健康查體內(nèi)鏡表現(xiàn)正常者20例，其中男12例，女8例，年齡(49．1±13．8)歲，檢查前2周無服用非甾體類藥物、質(zhì)子泵抑制劑、抗生素、鉍劑和飲酒等病史。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1．2 實(shí)驗材料 RPMI 1640培養(yǎng)液為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，Lowry蛋白定量試劑盒、人MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，快速尿素酶試劑盒為福建三強(qiáng)化工有限公司產(chǎn)品，13C尿素呼氣試驗診斷試劑盒為北京勃然制藥有限公司產(chǎn)品。RPMI 1640培養(yǎng)液使用前配制為含5%熱滅活的胎牛血清，15 mmol/L HEPES緩沖液，100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素，10 mg/mL PHA。

1．3 胃鏡檢查獲取病理組織 所有患者行胃鏡檢查，實(shí)驗組在胃竇區(qū)取3塊，1塊用于H．pylori快速尿素酶檢測，1塊用于組織學(xué)檢查并行 Giemsa染色檢測H．pylori，1塊用于組織培養(yǎng)檢測MMP-9和TIMP-1。在胃潰瘍邊緣取2塊，1塊用于組織學(xué)檢查，1塊用于組織培養(yǎng)檢測MMP-9和TIMP-1。對照組在胃竇區(qū)取3塊。

1．4 H．pylori感染的確定 在快速尿素酶、13C尿素呼氣試驗及Giemsa染色三者中有二者為陽性則確定為H．pylori感染，三者均為陰性則定義為陰性，三者之一陽性者定義為陰性，但作為排除病例，不入組。

1．5 組織培養(yǎng)及MMP-9、TIMP-1的檢測 將組織標(biāo)本置于含3 mL RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)小瓶中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液上清，于－70℃保存。以Lowry蛋白定量試劑盒測定組織標(biāo)本的蛋白含量，以人MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒測定培養(yǎng)液上清中MMP-9、TIMP-1的含量，結(jié)果以mg/mL表示。

1．6 組織學(xué)評價 組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色，根據(jù)改良的悉尼標(biāo)準(zhǔn)［1］，評價活動度(中性粒細(xì)胞浸潤)、炎癥(單個核細(xì)胞浸潤)、萎縮和腸上皮化生的程度，分為四級，0、1、2、3，分別代表無、輕度、中度和重度。

2 結(jié)果

2．1 MMP-9、TIMP-1在實(shí)驗組與對照組間的表達(dá)情況 經(jīng)單因素方差分析，MMP-9在實(shí)驗組的胃潰瘍部位的表達(dá)(51．6±20．3)mg/mL明顯高于胃竇部位(35．9±6．5)mg/mL(P=0．000)，也高于對照組(23．1 ±12．5)mg/mL(P=0．001)。而TIMP-1在實(shí)驗組的胃潰瘍部位的表達(dá)(31．5±6．7)mg/mL與胃竇部位(29．6±4．4)mg/mL的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．104)，但高于對照組(16．2±5．3)mg/mL(P=0．000)。

2．2 胃竇部MMP-9、TIMP-1在H．pylori陽性組與陰性組間的表達(dá)情況 H．pylori陽性者52例，陰性者18例，經(jīng)t檢驗，胃竇部MMP-9在H．pylori陽性者的表達(dá)(37．7±4．9)mg/mL高于陰性者(16．6±3．4) mg/mL(t=16．797，P=0．000)。而TIMP-1在H．pylori陽性者的表達(dá)(28．5±5．9)mg/mL高于H．pylori陰性者(17．9±6．6)mg/mL(t=6．402，P=0．000)。

2．3 胃竇部MMP-9、TIMP-1表達(dá)與組織學(xué)分級的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，在胃竇部MMP-9和TIMP-1與組織學(xué)的活動性及炎癥分級相關(guān)，而與萎縮、腸上皮化生分級等無相關(guān)性(見表1)。胃竇部MMP-9與TIMP-1的表達(dá)存在正相關(guān)(r=0．366，P= 0．002)。

表1 MMP-9、TIMP-1的表達(dá)與組織學(xué)分級的相關(guān)性分析Tab 1 Correlation of MMP-9 or TIMP-1 expression w ith gastric histological degrees

3 討論

防治消化性潰瘍的復(fù)發(fā)依然是治療消化性潰瘍的一大難題。研究表明，在根除H．pylori治療后潰瘍的年復(fù)發(fā)率為6．45%，H．pylori陽性的潰瘍年復(fù)發(fā)率可達(dá)23．33%［2］。潰瘍的修復(fù)可分為四個相互重疊的過程:凝血期、炎癥期、移行增殖期(包括基質(zhì)的沉積)和重建期，在此期間，MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要降解酶，參與組織再塑形和修復(fù)、炎癥細(xì)胞的募集及促進(jìn)上皮再生等［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9是上皮再生的關(guān)鍵因素之一，過度表達(dá)的MMP-9與上皮再生缺陷有關(guān)，并降低連接復(fù)合物的完整性，影響潰瘍愈合的質(zhì)量。愈合質(zhì)量差，是潰瘍復(fù)發(fā)的根源。本研究采用組織培養(yǎng)的方法，觀察潰瘍微環(huán)境下MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，較血清學(xué)測定更能反映潰瘍部位 MMP-9、TIMP-1的變化。我們發(fā)現(xiàn)，在胃潰瘍部位的MMP-9濃度明顯升高，MMP-9的表達(dá)在胃潰瘍部位高于潰瘍組的胃竇部，同時高于對照組的胃竇部。而TIMP-1在胃潰瘍部位、胃竇部無差異，但高于對照組的胃竇部。在大鼠乙醇急性胃潰瘍模型中，隨TNF-α、IL-6的增加，MMP-9、MMP-2分泌增加，潰瘍的嚴(yán)重性與乙醇的用量、MMP-9、MMP-2的活性呈正比，MMP-9和MMP-2的活性降低與 TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)增加有關(guān)［4］。在小鼠非甾體類藥物相關(guān)潰瘍模型中，同樣發(fā)現(xiàn)伴隨著炎癥細(xì)胞的浸潤及黏膜的破壞，MMP-9、MMP-3活性增加［5］。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，H．pylori陽性者其MMP-9、TIMP-1的表達(dá)明顯高于陰性者。在H．pylori感染的胃炎患者中也發(fā)現(xiàn)MMP-8、MMP-9、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、MMP-2及TIMP-1表達(dá)的變化［6］。而在兒童型胃炎中的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9基因1562C/T多態(tài)性在慢性胃炎組中，C/C基因型攜帶者發(fā)生H．pylori感染的風(fēng)險是T等位基因(C/T+T/T)攜帶者的3．1倍，該基因位點(diǎn)的C/C基因型攜帶者可能與H．pylori易感性相關(guān)［7］。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MMP-9、TIMP-1的表達(dá)與組織學(xué)的炎癥及活動度分級相關(guān)，提示局部的 MMP-9和TIMP-1的表達(dá)與H．pylori感染引起的炎癥活動有關(guān)。可能的原因是H．pylori感染引起胃黏膜產(chǎn)生炎癥細(xì)胞及因子，刺激黏膜產(chǎn)生MMPs。在對胃上皮細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，H．pylori感染可激活NF-κB導(dǎo)致MMP-9基因轉(zhuǎn)錄。而在H．pylori根除后，MMP-9水平顯著降低［8］。

胃竇部MMP-9與TIMP-1的表達(dá)存在正相關(guān)，提示TIMP-1是對MMP-9的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。我們假設(shè)，在潰瘍形成早期，MMP-9的量及活性增加，主要來源于炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)基質(zhì)與細(xì)胞間的黏附作用，刺激細(xì)胞遷移來促進(jìn)上皮再生。而在慢性潰瘍中，損傷和修復(fù)共存，此時MMP-9的高表達(dá)會阻止傷口的自發(fā)愈合，TIMP-1表達(dá)增加抑制MMP-9的活性有利于潰瘍愈合。加強(qiáng)MMPs及TIMPs在胃潰瘍發(fā)病機(jī)制中的作用研究，有可能發(fā)現(xiàn)提高潰瘍愈合質(zhì)量的途徑，開發(fā)新的治療藥物，進(jìn)一步降低潰瘍的復(fù)發(fā)。

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