徐文娟，羅和生，梁成柏，劉 穎，夏 虹

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430060

促甲狀腺激素釋放激素(TRH)是從下丘腦中分離和提純的化學(xué)結(jié)構(gòu)為焦谷氨酰-組氨酰-脯氨酰胺的三肽激素，在垂體前葉細(xì)胞上有TRH特異性受體，腦室內(nèi)注射TRH后，可引起近端十二指腸基本電節(jié)律的振幅增加，頻率減少，并且?guī)缀趺恳恢芷诘幕倦姽?jié)律均伴有鋒電位的爆發(fā)，但對遠(yuǎn)端十二指腸、空腸和回腸的肌電圖沒有影響［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)TRH在胃腸道中廣泛分布，用放射免疫組織化學(xué)法顯示TRH在胰腺、盲腸和胃底中含量最高［2］，已有TRH對大鼠離體胃竇肌條、幽門括約肌和結(jié)腸機械活動作用的研究報道，發(fā)現(xiàn)TRH不影響這三種組織的收縮頻率，但明顯加強它們的收縮幅度［3］。而TRH對離體十二指腸實驗顯示，TRH可使十二指腸平滑肌舒張，但作用短暫，并且該作用不被TTX阻斷，提示TRH不需要腸內(nèi)在神經(jīng)叢的參與可直接影響平滑肌收縮［4］。研究報道，TRH能降低大鼠腺垂體GH3/B6細(xì)胞快速延遲整流鉀通道(ether-à-go-go related gene，egr)電流，并能調(diào)節(jié)erg1、erg2、erg3和HERG的表達(dá)［5］。本實驗采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察TRH對單個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流(Ito)和延遲整流鉀電流(Ik)的影響，從離子通道水平探討TRH對胃腸動力的作用機制。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器 Ⅱ型膠原酶和牛血清白蛋白購自GIBCO公司，胰蛋白酶抑制劑購自AMRESCO公司，TRH、HEPES、NaCl、KCl、CaCl2、葡萄糖等均購自美國Sigma公司。法國Millipore公司Milli-Q Plus純水機，德國HEKA公司EPC10膜片鉗放大器，日本Olympus公司IX71倒置顯微鏡，德國 List Electronics公司 L/ M-sps-8型8通道灌流系統(tǒng)，美國Sutter科學(xué)儀器公司P97膜片鉗微電極拉制儀，瑞士 Mettler Toledo公司AB-104電子天秤和DELTA 320 pH計。

1．2 主要溶液 臺氏液(mmol/L):NaCl 147，KCl 4，CaCl22，NaH2PO40．42，Na2HPO42，MgCl21．05，Glucose 5．5，以NaOH調(diào)pH 7．4;Ca-free PSS(mmol/L): NaCl 134．8，KCl 4．5，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，以Tris調(diào)pH 7．4;記錄鉀電流的電極內(nèi)液成分(mmol/ L):天冬氨酸110，Mg-ATP 5，HEPES 5，MgCl21，KCl 20，EGTA 10，CdCl21，di-tris-creatinephosphate 2．5，disodium-creatine phosphate 2．5，以KOH調(diào)pH 7．3;記錄鉀電流的細(xì)胞外液為臺式液。

1．3 單個大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的分離 取成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，頸椎脫臼處死，剪開腹腔，取近端結(jié)腸約5 cm，在氧飽和無鈣PSS中小心洗凈腸內(nèi)容物，沿縱軸剖開，將結(jié)腸固定于硅膠板上。在解剖顯微鏡下小心地分離黏膜層和黏膜下層得到肌條。將肌條剪成2 mm×4 mm小塊，4℃無鈣PSS保存10 min。用含1%Ⅱ型膠原酶、1%胰蛋白酶抑制劑、2%牛血清白蛋白的消化液于37℃消化15 min左右，再用無鈣PSS沖洗3次洗凈消化酶后置于4℃冰箱備用，實驗前用吸管反復(fù)吹打直至液體變渾濁，取上清液即可得單個大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞。

1．4 Ito和Ik的記錄 取細(xì)胞懸浮液約1 mL置于倒置顯微鏡下，靜置10 min，待細(xì)胞完全貼壁后，用含鈣的臺氏液進(jìn)行灌流(3 mL/min)，選擇邊緣整齊、表面光滑無顆粒、無收縮的細(xì)胞備用。經(jīng)微電極拉制器二步拉制成尖端為1～1．5 μm的電極，充灌記錄鉀電流的電極內(nèi)液。電極入水后電阻為3～5 MΩ，補償液接電位，調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細(xì)胞表面，再行封接，封接電阻達(dá)1 GΩ以上，補償快電容并吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞模式。在－80 mV電壓鉗制下，以20 mV為階躍，給予步階刺激從－80 mV到+60 mV，時程700 ms，記錄Ito和Ik脈沖電流，由德國HEKA公司Pulse軟件控制，經(jīng)EPC-10放大器放大后，通過AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的玻璃微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-10放大器轉(zhuǎn)換，由Pulse軟件收集并存儲于計算機的硬盤中。在細(xì)胞外液中加入不同濃度的TRH，記錄其對Ito和Ik的影響。

2 結(jié)果

2．1 TRH對大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ito的影響 采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方式研究TRH對大鼠單個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ito的作用，在細(xì)胞外液中定量加入TRH，使其終濃度分別為10、20、50、100 μmol/L，實驗表明TRH能濃度依賴性抑制大鼠單個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ito(n=12，P＜0．05)。將細(xì)胞鉗制在－80 mV，階躍20 mV，逐級去極化至+60 mV，可見一系列呈電壓和時間依賴性的外向鉀電流，其激活電位為－40 mV。分別向細(xì)胞外液中加入10、20、50、100 μmol/L TRH，觀察到在不同指令電壓水平，TRH 10、20、50、100 μmol/L均使Ito減小，當(dāng)階躍刺激為+60 mV時，對照組、10、20、50、100 μmol/L TRH組的Ito分別為(1 368．3±43．0)pA、(1 185．2± 78．2)pA、(985．2±46．4)pA，(828．3±58．9)pA、(637．1 ±25．6)pA，10、20、50、100 μmol/L TRH組的Ito與對照組相比，分別降低了13．4%、28．0%、39．5%、53．4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=12，P＜0．05)(見圖1A)。在上述條件下，以不同電壓水平的Ito和相應(yīng)的電壓繪制不同濃度TRH電流-電壓曲線，可見在－40 mV電流激活以后10、20、50、100 μmol/L TRH均使Ito的電流-電壓曲線下移，并呈現(xiàn)濃度依賴性，但不使電流-電壓曲線峰值偏移(見圖1B)。

圖1 A:不同濃度TRH對Ito的影響;B:不同濃度TRH對Ito電流-電壓曲線的影響Fig 1 A:Effects of TRH on Ito;B:Effects of TRH on I-U curve of Ito

2．2 TRH對大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ik的影響 采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方式研究TRH對大鼠單個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ik的作用，實驗表明TRH對大鼠單個結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ik無影響(n=12，P＞0．05)。在－80 mV鉗制電壓下，階躍20 mV，逐級去極化至+60 mV，可見一系列呈電壓和時間依賴性的外向鉀電流，其激活電位是－40 mV。當(dāng)階躍刺激為+60 mV時，對照組Ik為(792．7±73．5)pA，100 μmol/L TRH組的Ik為(809．8±58．0)pA，與對照組相比，升高2．2%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(n=12，P＞0．05)(見圖2A)。在上述條件下，以不同電壓水平的Ik和相應(yīng)的電壓繪制100 μmol/L TRH的電流-電壓曲線，可見在－40 mV電流激活以后TRH對Ik的電流-電壓曲線無明顯改變(見圖2B)。

圖2 A:100 μmol/L TRH對Ik的影響;B:100 μmol/L TRH對Ik電流-電壓曲線的影響Fig 2 A:Effects of TRH on Ik;B:Effects of TRH on I-U curve of Ik

3 討論

在胃腸道平滑肌里存在的主要電壓依賴性離子通道有電壓依賴性鈣通道、延遲整流鉀通道、鈣敏感鉀電流通道、瞬時外向鉀電流(Ito)通道，又稱A型電流等。鉀通道一般被膜電位去極化和/或胞內(nèi)鈣離子激活，使鉀離子外流引起膜電位超極化抑制平滑肌收縮，導(dǎo)致平滑肌舒張。神經(jīng)遞質(zhì)和胃腸道激素通過受體和第二信使系統(tǒng)作用于離子通道，從而對腸道平滑肌電生理和收縮活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。

TRH主要存在于丘腦下部正中隆起，中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外主要存在于胃腸道和胰腺中，作為一種腦腸肽，其對胃腸道的分泌、消化和運動功能及攝食活動等有廣泛的影響。TRH通過與細(xì)胞膜表面TRH受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，TRH受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族［6］。Miranda等［7］采用穿孔膜片鉗研究TRH受體對大鼠腺垂體GH3細(xì)胞r-ERG的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)Gq/11蛋白不參與TRH對內(nèi)源性r-ERG電流的抑制作用，而βγ二聚體從G蛋白的釋放調(diào)節(jié)TRH對ERG的觸發(fā)。erg K+通道在胃腸道的電活動中扮演了重要的角色-調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌慢波電位發(fā)生的頻率和持續(xù)的時間［8］。

Ik影響膜的靜息電位、動作電位閾值和慢波的波形，可調(diào)節(jié)刺激引發(fā)的電反應(yīng)。Ito因其激活、失活以及從穩(wěn)態(tài)失活的復(fù)活過程都很迅速而得名，是動作電位潛伏期外向電流的主要成分，主要調(diào)節(jié)靜息膜興奮性，減慢去極化速度，延緩動作電位的產(chǎn)生。因此Ito的變化對細(xì)胞的興奮性具有重要的影響。目前已明確有兩種類型的Ito，一種為對4-AP敏感而對鈣不敏感的鉀通道，稱為Ito1;另一種為鈣依賴性的氯通道，稱為Ito2，能被caffeine、Co2+阻斷。本研究中所用電極液中含高濃度的鈣絡(luò)合劑EGTA(10 mmol/L)和鈣通道阻斷劑CdCl2(1 mmol/L)，因此，本研究記錄的瞬間外向鉀電流是Ito1而不包含Ito2。

本實驗研究通過TRH對Ito和Ik的作用顯示10、20、50、100 μmol/L TRH能明顯抑制Ito，并呈現(xiàn)濃度依賴性，在指令電壓為+60 mV時，電流達(dá)峰值，與用藥前比較其峰值明顯減少，100 μmol/L TRH可使峰值明顯降低，說明TRH可阻滯大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Ito;而當(dāng)指令電壓為+60 mV時，100 μmol/L TRH對Ik的作用不顯著，表明TRH對大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Ik無抑制作用。

研究報道，TEA敏感的Ik對小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞動作電位幅度起決定作用，該電流增加峰電位幅度，但對基礎(chǔ)電節(jié)律無影響。而4-AP敏感的Ik改變慢波節(jié)律，產(chǎn)生連續(xù)峰電位，它決定峰電位的爆發(fā)，并認(rèn)為該電流的電生理特性類似于神經(jīng)和其他平滑肌細(xì)胞上的A型電流［9］。本實驗結(jié)果表明TRH抑制鉀電流的作用不是通過Ik，而與Ito通道有關(guān)。分子生物學(xué)研究已證明，Kv 1．4、Kv 4．2和Kv 4．3克隆與Ito有關(guān)，Kv通道互作蛋白(KChIPs)對通道的表達(dá)和功能起重要作用。Amberg等［10］研究表明Kv 4．3是小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞鉀電流的主要表達(dá)分子，Kv 4．3與KChIP1可能增加Ito表達(dá)的幅度和密度，對Ito起決定作用。同樣也有研究報道，雌激素不影響小鼠結(jié)腸細(xì)胞Ik，但能抑制A型電流，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性，并且在雌激素降低A型電流組中發(fā)現(xiàn)，Kv 4．3的轉(zhuǎn)錄與對照組相比無明顯變化，而KChIP1在去卵巢組明顯升高，說明雌激素對結(jié)腸動力的調(diào)節(jié)與KChIP1介導(dǎo)的A型電流有關(guān)［11］。因此推測TRH抑制結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ito是否也與Kv 4．3和KChIP1有關(guān)，還需更多的研究證明。

同時本實驗中TRH對Ik無明顯作用，而Schledermann等［5］研究表明，TRH可減少垂體前葉erg電流，并且TRH影響erg1通道的過度表達(dá)不通過任何已知的信號通路介導(dǎo)。TRH對Ik的這種差異可能是由于種屬及組織特異性造成的。此外，由于TRH對Ito的顯著作用，而對于所有的種屬，在考慮Ito變化對動作電位形態(tài)的凈作用時尤其要考慮的兩種電流是 ICa-L和INa/Ca，因為它們在決定收縮力、產(chǎn)生節(jié)律失常如早后除極和遲后除極中發(fā)揮重要作用［12］。已有研究報道TRH通過水解磷酸肌醇經(jīng)IP3和PKC途徑提高胞內(nèi)游離鈣濃度參與鉀電流的調(diào)節(jié)，鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ和鈣調(diào)磷酸酶在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Ito的失活中起重要作用［13-15］，但TRH經(jīng)受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)系統(tǒng)影響Ito，其具體機制需進(jìn)一步實驗以闡明。

本研究結(jié)果表明，TRH可濃度依賴性抑制大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的Ito，不能降低Ik，因此，TRH可能通過阻滯Ito通道鉀離子外流改變動作電位潛伏期外向電流，加快去極化速度，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性影響平滑肌的收縮，這可能是TRH改變胃腸道動力的機制之一，同時是否還有其他機制的參與，還需進(jìn)一步的研究探討。

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