趙旭東 高曉唯 李文靜 劉 瑩 周 昕 楊 磊

角膜融解是多種致病因素所引起的非感染性角膜潰瘍，可發(fā)生于多種角膜病中，其確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚［1］，可能的機(jī)制為:(1)堿燒傷后大量的多形核白細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原酶對(duì)角膜膠原的不斷消化以及氧自由基對(duì)角膜細(xì)胞的毒性破壞［2］;(2)免疫炎性細(xì)胞［3］(包括淋巴細(xì)胞、Langerhan細(xì)胞等)和免疫分子［4］(如細(xì)胞因子、黏附因子、趨化因子等)相互聯(lián)系、相互作用，形成復(fù)雜的免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)角膜的病理變化。這些都與膠原酶對(duì)角膜的破壞有關(guān)，抑制角膜融解可以減少角膜產(chǎn)生的抗原，從而減少白細(xì)胞聚集，打破惡性循環(huán)，達(dá)到治療角膜融解的目的。

角膜膠原交聯(lián)術(shù)是一種用于治療圓錐角膜的方法，在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能增強(qiáng)角膜對(duì)多種酶的耐受，有抗菌、增強(qiáng)角膜硬度的作用［5］，但對(duì)堿燒傷后的角膜融解的治療效果尚未見(jiàn)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用家兔角膜堿燒傷后融解的動(dòng)物模型，觀察角膜膠原交聯(lián)對(duì)角膜融解的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔25只，體質(zhì)量(2.0±0.5)kg，雌雄不限，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。造模前裂隙燈及眼底鏡檢查眼部無(wú)異常。

1.1.2 主要儀器和試劑 角膜交聯(lián)儀(巴西OPTO Electronics S.A.Opto-XLink角膜膠原交聯(lián)治療系統(tǒng))。核黃素眼液的配制方法:由解放軍474醫(yī)院藥劑科在無(wú)菌條件下用T500右旋糖酐(Pharmacia公司產(chǎn)品)2 g融解于10 mL生理鹽水中，核黃素10 mg融解于200 g·L－1的T500右旋糖酐，配制成濃度為1 g·L－1核黃素眼液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩＂裥湍z原抗體(美國(guó)Santa公司)，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒及兔Streptavidin-HRP試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將25只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(5只10眼)、模型對(duì)照組(10只10眼)、膠原交聯(lián)治療組(10只10眼)。模型對(duì)照組和膠原交聯(lián)治療組右眼為造模眼，左眼不做處理;正常對(duì)照組雙眼均不做處理。

1.2.2 堿燒傷動(dòng)物模型的制備 術(shù)前15 min以50 mg·kg－1劑量的復(fù)方氯胺酮(50 g·L－1)和10 mg· kg－1鹽酸氯丙嗪(25 g·L－1)肌肉注射麻醉成功后，4 g·L－1鹽酸奧布卡因眼部表面麻醉。將浸潤(rùn)1 mol·L－1氫氧化鈉溶液60 s、直徑8 mm的濾紙片置于兔右眼角膜中央，約30 s后取下濾紙片，立即用生理鹽水沖洗角膜約2 min。形成角膜中央邊界清楚的圓盤(pán)狀白色燒傷區(qū)，依據(jù)Hughes分度法確認(rèn)中度堿燒傷模型建立。

1.2.3 膠原交聯(lián)治療過(guò)程 4滴氯霉素眼液和2滴20 g·L－1毛果蕓香堿眼液滴眼后，以配置好的1 g· L－1核黃素眼液滴眼，每5 min 1次，共30 min。觀察角膜呈黃綠色浸潤(rùn)后，打開(kāi)角膜交聯(lián)儀，垂直于角膜，距離45 mm，以370 nm波長(zhǎng)紫外線A在角膜燒傷區(qū)8 mm直徑區(qū)域，3 mW·cm－2的輻照度治療30 min。治療過(guò)程中1 g·L－1核黃素眼液滴眼，每5 min 1次。

1.2.4 給藥方法 造模后，模型對(duì)照組滴核黃素眼液30 min后涂紅霉素眼膏;膠原交聯(lián)治療組膠原交聯(lián)治療后涂紅霉素眼膏。各組次日起氯霉素眼液滴眼，每天3次，抗感染治療，均治療28 d。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 角膜混濁、角膜融解評(píng)分 堿燒傷造模成功后每日裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜混濁情況，并進(jìn)行角膜融解評(píng)分。角膜融解評(píng)分參照Pfister等［6］建立的標(biāo)準(zhǔn)，角膜混濁評(píng)分參照Holland等［7］建立的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 一般病理檢查和免疫組織化學(xué)染色 造模成功后28 d，3組動(dòng)物處死后摘取眼球，取角膜，行HE染色，觀察角膜組織病理學(xué)改變。隨機(jī)抽取未經(jīng)染色的切片，脫蠟水化、抗原修復(fù)，免疫組織化學(xué)染色方法按兔 Streptavidin-HRP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色后蘇木素復(fù)染。觀察角膜各層中Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)情況。角膜組織內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。在低倍視野下選取角膜組織，用Olympus BX41計(jì)算機(jī)彩色圖像分析系統(tǒng)采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本文所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，各組間計(jì)數(shù)資料比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無(wú)感染及意外死亡者。正常對(duì)照組觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)變化。模型對(duì)照組、膠原交聯(lián)治療組造模成功后即可見(jiàn)一邊界清楚的角膜水腫混濁區(qū)，隨后角膜水腫逐漸減輕，治療期間，角膜上皮反復(fù)再生、剝脫。

2.1.1 角膜融解情況 觀察期內(nèi)模型對(duì)照組6眼角膜發(fā)生融解，膠原交聯(lián)治療組1眼發(fā)生角膜融解，兩組角膜融解發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.029＜0.05)。模型對(duì)照組角膜融解出現(xiàn)的時(shí)間為造模后9～20(14±4)d，膠原交聯(lián)治療組角膜融解出現(xiàn)的時(shí)間為造模后23 d，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.148，P=0.254＞0.05)。

2.1.2 角膜穿孔發(fā)生的時(shí)間 觀察期內(nèi)模型對(duì)照組角膜穿孔2眼，分別發(fā)生于造模后的21 d和25 d;膠原交聯(lián)治療組無(wú)角膜穿孔眼，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.237＞0.05)。

2.1.3 角膜融解的評(píng)分 造模后28 d時(shí)，模型對(duì)照組角膜融解評(píng)分平均為2.0分，膠原交聯(lián)治療組為0.3分;兩組角膜融解的臨床評(píng)分經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=－2.487，P=0.035＜0.05)。

2.1.4 角膜混濁評(píng)分情況 造模后5 d，模型對(duì)照組和膠原交聯(lián)治療組角膜的混濁程度相同。模型對(duì)照組造模后9 d角膜混濁開(kāi)始加重，至后期角膜完全混濁。膠原交聯(lián)治療組自造模后7 d角膜混濁開(kāi)始減輕，至治療結(jié)束時(shí)，角膜混濁程度始終低于模型對(duì)照組。造模后28 d，模型對(duì)照組評(píng)分平均為4分，膠原交聯(lián)治療組評(píng)分平均為3分，經(jīng)秩和檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=－3.559，P=0.002＜0.05)。

2.2 角膜HE染色檢查 正常對(duì)照組:角膜各層層次清晰，角膜基質(zhì)排列規(guī)則(圖1A);模型對(duì)照組:角膜水腫，上皮增生明顯，基質(zhì)層破壞嚴(yán)重，膠原纖維發(fā)生退行性變，排列紊亂，角膜層間有嗜酸性顆粒物堆積，可見(jiàn)機(jī)化纖維，角膜基質(zhì)層可見(jiàn)大量的顆粒性白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B);膠原交聯(lián)治療組:角膜上皮增生，前基質(zhì)層可見(jiàn)膠原纖維破壞，但程度較輕，前部可見(jiàn)顆粒性白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型對(duì)照組，角膜基質(zhì)層深部膠原纖維排列規(guī)則，角膜腫脹較輕(圖1C)。

2.3 Ⅰ型膠原表達(dá) 正常對(duì)照組:Ⅰ型膠原在角膜基質(zhì)層排列規(guī)則，層次清楚(圖2A);模型對(duì)照組:膠原纖維發(fā)生退行性變，角膜基質(zhì)全層排列紊亂，層間隙明顯(圖2B);膠原交聯(lián)治療組:前基質(zhì)層可見(jiàn)膠原纖維破壞，后部排列整齊(圖2C)。

Figure 1 Rabbit corneal tissue HE staining(×100).A:Normal control group，hierarchical layers of the cornea cleared，corneal stroma arranged regularly;B:Model control group，corneal edema appeared，epithelium was proliferated，the stroma damaged severely，the fiber arranged irregularly，and corneal stroma showed a large number of particles of leukocyte infiltration;C:Collagen cross-linking treatment group，corneal epithelium was proliferated，light fiber damage before the matrix layer was seen，anterior visible particles leukocyte infiltration was less than that in model control group，the deep corneal stroma fibers arranged regularly 兔角膜組織病理切片HE染色(×100)。A:正常對(duì)照組，角膜各層層次清晰，角膜基質(zhì)排列規(guī)則;B:模型對(duì)照組，角膜水腫，上皮增生明顯，基質(zhì)層破壞嚴(yán)重，膠原纖維排列紊亂，基質(zhì)層可見(jiàn)大量的顆粒性白細(xì)胞浸潤(rùn);C:膠原交聯(lián)治療組，角膜上皮增生，前基質(zhì)層可見(jiàn)膠原纖維破壞，但程度較輕，前部可見(jiàn)顆粒性白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型對(duì)照組，角膜基質(zhì)層深部膠原纖維排列規(guī)則

3 討論

角膜融解一直是眼科臨床較為棘手的問(wèn)題［8］，隨著病情的發(fā)展可致角膜穿孔，最終造成永久的視力障礙。角膜融解的病因繁多，包括角膜堿燒傷、免疫因素、感染以及眼部手術(shù)等，因發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床上還沒(méi)有根治的辦法。目前的藥物對(duì)癥治療包括［9］:(1)抗炎治療;(2)膠原酶抑制劑:依地酸二鈉、半胱氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等;(3)促進(jìn)膠原蛋白和組織細(xì)胞間質(zhì)合成:維生素C、纖維連接蛋白;(4)白細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑:枸櫞酸鈉;(5)免疫抑制劑。這些治療在體外實(shí)驗(yàn)中有一定效果，但臨床治療效果并不明顯。

角膜膠原交聯(lián)治療使用核黃素為交聯(lián)劑，選擇370 nm波長(zhǎng)的紫外線A照射后，核黃素被激發(fā)產(chǎn)生活性氧自由基，后者可進(jìn)一步與角膜膠原纖維之間和內(nèi)部各種分子相互作用形成共價(jià)鍵連接，增強(qiáng)角膜硬度［10］。超微結(jié)構(gòu)顯示交聯(lián)后膠原纖維直徑增加，角膜板層間的纖維連接增強(qiáng)，層內(nèi)的纖維連接增加［11］。Spoerl等［5］在體外實(shí)驗(yàn)研究角膜經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、膠原酶和胰蛋白酶作用后，交聯(lián)后的角膜分別在13 d、14 d和5 d出現(xiàn)融解，而未經(jīng)處理的角膜分別在6 d、6 d和2 d出現(xiàn)融解。提示膠原交聯(lián)或許可以應(yīng)用于角膜潰瘍的治療。Spoerl等［5］和Schilde等［12］推測(cè)可能是由于交聯(lián)之后膠原纖維之間形成新的共價(jià)鍵，形成新的分子空間結(jié)構(gòu)，影響膠原酶對(duì)相應(yīng)分子位點(diǎn)的破壞，從而使經(jīng)過(guò)紫外光核黃素交聯(lián)治療后的角膜對(duì)抗各種酶消化作用的能力顯著加強(qiáng)。

Figure 2 Expression of collagen typeⅠin rabbit cornea(×100).A:Normal control group，collagen expression located in corneal stroma and arranged regularly;B:Model control group，the collagen fiber had anaplasia，the whole corneal stroma arranged irregularly，layer gaps were clear;C:Collagen cross-linking treatment group，the collagen fibers in anterior corneal stroma were damaged，but which in posterior corneal stroma arranged regularly Ⅰ型膠原在兔角膜中的表達(dá)(×100)。A:正常對(duì)照組，表達(dá)位于角膜基質(zhì)層，排列規(guī)則;B:模型對(duì)照組，膠原纖維發(fā)生退行性變，角膜基質(zhì)全層排列紊亂，層間隙明顯;C:膠原交聯(lián)治療組，前基質(zhì)層可見(jiàn)膠原纖維破壞，后部排列整齊

本研究采用兔角膜中度堿燒傷角膜融解模型，觀察角膜膠原交聯(lián)術(shù)在治療角膜融解中的作用。結(jié)果顯示:角膜膠原交聯(lián)治療可使角膜堿燒傷后角膜融解發(fā)生率降低，角膜混濁的程度減輕。病理切片顯示角膜膠原交聯(lián)治療后角膜上皮增生輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，深層角膜破壞少。免疫組織化學(xué)染色顯示治療后角膜膠原排列整齊，破壞較模型對(duì)照組輕。角膜膠原交聯(lián)治療角膜堿燒傷的機(jī)制可能有兩方面原因:(1)角膜經(jīng)過(guò)交聯(lián)，膠原纖維之間增加了共價(jià)鍵，膠原酶融解角膜能力降低，融解產(chǎn)物減少，打破了角膜堿燒傷后的惡性循環(huán);(2)角膜膠原交聯(lián)主要作用于前角膜基質(zhì)層，可以使角膜對(duì)水合作用耐受增加，減少角膜水腫［13-14］，保護(hù)了深層角膜組織，故深層角膜基質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，膠原纖維排列整齊。

本實(shí)驗(yàn)觀察了角膜膠原交聯(lián)治療對(duì)角膜堿燒傷后角膜融解的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原交聯(lián)治療可抑制和延遲堿燒傷后角膜融解的發(fā)生和發(fā)展，減輕角膜膠原纖維的破壞及減少角膜組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處，如觀察時(shí)間較短、樣本數(shù)量有限、角膜穿孔數(shù)量較少等。膠原交聯(lián)術(shù)是治療圓錐角膜的一種新方法，盡管在臨床報(bào)道中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的并發(fā)癥［15］，但是膠原交聯(lián)對(duì)堿燒傷后角膜的影響仍需要進(jìn)一步研究。

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