趙 斌， 王禮春， 莊曉東， 董小變， 黃澤娜， 鄺素娟， 劉曉穎， 廖新學(xué)△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，高血壓血管病科，2廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

盡管惡性心律失常是大多數(shù)心臟病患者的重要死因，但是誘導(dǎo)其發(fā)作的離子機(jī)制尚未完全闡明。心臟交替在臨床上常表現(xiàn)為交替脈，是由于心臟收縮強(qiáng)弱交替出現(xiàn)而引起的［1－2］，它是預(yù)測(cè)惡性心律失常及評(píng)估患者猝死風(fēng)險(xiǎn)的有效指標(biāo)［3］。最近，在細(xì)胞電生理方面的研究結(jié)果提示，心臟收縮的這種強(qiáng)弱交替現(xiàn)象與單個(gè)心肌細(xì)胞的鈣瞬變交替密切相關(guān)［4］。心肌細(xì)胞鈣瞬變交替是指高頻刺激、心肌缺血、糖代謝障礙以及酸中毒等病理狀態(tài)下出現(xiàn)的細(xì)胞膜去極化，L型鈣通道開放以及Ca2+內(nèi)流增加，進(jìn)而觸發(fā)肌漿網(wǎng)大量釋放Ca2+，從而形成了鈣瞬變幅度在心肌細(xì)胞的每次搏動(dòng)之間的交替變化［5－7］。因而，深入研究鈣瞬變交替在心肌缺血誘導(dǎo)的惡性心律失常和心肌功能受損中的作用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和臨床價(jià)值［8－10］。為此，我們分離成年SD大鼠的心室肌細(xì)胞，觀察缺氧處理對(duì)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變交替的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)鈣瞬變交替在缺氧損傷心室肌細(xì)胞中的作用。

材料和方法

1 材料和試劑

II型膠原酶、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、HEPES和Joklik－modified MEM無(wú)鈣培養(yǎng)基(無(wú)鈣培養(yǎng)基)購(gòu)自Sigma－Aldrich，F(xiàn)luo－4/ AM購(gòu)自Invitrogen，2－(2－甲氧基－4－硝苯基)－3－(4－硝苯基)－5－(2，4－二磺基苯)－2H－四唑單鈉鹽［2－(2－methoxy－4－nitrophenyl)－3－(4－nitrophenyl)－5－(2，4－disulfophenyl)－2H－tetrazolium，monosodium salt，WST－8］線粒體功能檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 SD大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離與缺氧處理

取雄性、3月齡SD大鼠，體重約250 g。通過(guò)吸入高濃度的CO2使其麻醉，快速將心臟組織完整地取出，浸泡于0℃無(wú)鈣培養(yǎng)基中。保留左冠狀動(dòng)脈，將其殘端懸掛于Langendorff灌流系統(tǒng)中，逆行灌流。用37℃ 無(wú)鈣培養(yǎng)基灌注3 min，以去除組織內(nèi)殘存的血液，接著用含有Ⅱ型膠原酶0.5g/L、BSA 1g/L和HEPES 10 mmol/L(pH 7.2)的無(wú)鈣培養(yǎng)基，37℃灌流40 min。待心室肌組織變軟，用眼科剪剪下心室組織，在15 mL離心管內(nèi)用無(wú)鈣培養(yǎng)基反復(fù)吹打，去除殘留的組織塊。靜置10 min后，丟棄上清液，純化心室肌細(xì)胞?；盍φ５男氖壹〖?xì)胞常呈棒狀，其數(shù)目約占總細(xì)胞數(shù)目的70%。將分離的心室肌細(xì)胞儲(chǔ)存于37℃的無(wú)鈣培養(yǎng)基中，備用。

心室肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理2 h，同時(shí)設(shè)置含鈣的Joklik－modified MEM培養(yǎng)基作為對(duì)照。缺氧液的成分為(mmol/L):NaCl 135、KCl 3.6、KH2PO41.2、MgSO41.2、HEPES 10和CaCl21.8，并將pH調(diào)節(jié)至6.5。臨用前通入N2，以排除溶解的O2。

3 心室肌細(xì)胞的復(fù)鈣和鈣熒光負(fù)載處理

將分離的心室肌細(xì)胞逐漸梯度復(fù)鈣，保持細(xì)胞外液中的Ca2+濃度在1.3 mmol/L左右。采用熒光探針Fluo－4/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量。在負(fù)載細(xì)胞時(shí)，取復(fù)鈣好的細(xì)胞懸液2 mL，加入10 mol/L Fluo－4/AM，37℃避光孵育20 min，使其在細(xì)胞內(nèi)充分水解，然后用含1.25 mmol/L Ca2+的 Joklikmodified MEM培養(yǎng)基洗滌3次，重懸后備用。分離的心室肌細(xì)胞要求在分離后8 h內(nèi)使用。

4 心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的檢測(cè)

按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［12］，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica;型號(hào):SP5)檢測(cè)心室肌細(xì)胞內(nèi)的鈣瞬變(入射波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm)。將備好的心室肌細(xì)胞放到載物臺(tái)上的灌流槽中，室溫26℃的條件下，以含1.25 mmol/L Ca2+的 Joklikmodified MEM培養(yǎng)基緩慢持續(xù)灌流，保持流速在0.2 mL/min。將顯微鏡的視野限制在單個(gè)心室肌細(xì)胞上，先用平面掃描(xyt)的方式沿著細(xì)胞的長(zhǎng)軸定下掃描線的具體位置，盡量避開細(xì)胞核，再用線掃描(xt pinhole 90 NA)的方式實(shí)時(shí)記錄電壓刺激(閾上刺激，平均強(qiáng)度為10 V，脈寬1 ms)時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系，即鈣瞬變。鈣瞬變交替是指鈣瞬變幅度大小交替出現(xiàn)，并相差達(dá)10%以上。電刺激頻率按60、120、180、240和300 min－1逐漸遞增，將出現(xiàn)鈣瞬變交替的最低刺激頻率定義為鈣瞬變交替的閾頻率。在200～300 min－1的范圍內(nèi)，以 2 min－1的幅度遞增，進(jìn)一步在不同的心室肌細(xì)胞檢測(cè)出閾刺激。用激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采集信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)表示，數(shù)據(jù)用該系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行分析。

5 心室肌細(xì)胞線粒體脫氫酶活性的檢測(cè)

線粒體脫氫酶活性是反映線粒體功能的重要指標(biāo)，其可代謝WST－8生成黃色的物質(zhì)。通過(guò)檢測(cè)黃色物質(zhì)的深淺可以間接反映線粒體的功能狀態(tài)。將分離的心室肌細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，分別給予含鈣的Joklikmodified MEM培養(yǎng)基、缺氧液、缺氧液+L－型鈣通道阻滯劑以及單獨(dú)L－型鈣通道阻滯劑處理4 h。處理結(jié)束后，每孔加1∶10稀釋的 WST－8溶液100 μL，輕搖，37°C孵育3 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(A)。將對(duì)照組心室肌細(xì)胞的線粒體脫氫酶活性設(shè)為100%。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 高頻起搏誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣瞬變交替

心室肌細(xì)胞被施予60～240 min－1起搏刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的熒光信號(hào)隨刺激而出現(xiàn)變化，表現(xiàn)為鈣瞬變現(xiàn)象(圖1A、B和C)。當(dāng)起搏刺激的頻率進(jìn)一步增加到300 min－1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的熒光信號(hào)除有鈣瞬變現(xiàn)象以外，還表現(xiàn)出強(qiáng)弱交替的變化(圖1D)，即高頻起搏刺激誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣瞬變交替現(xiàn)象。

Figure 1.Effects of different frequencies of pacing stimuli on calcium transient in ventricular myocytes.A:60 min－1;B:180 min－1; C:240 min－1;D:300 min－1.MFI:mean fluorescence intensity.圖1 不同頻率的起搏刺激對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的影響

2 缺氧處理易化高頻起搏刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替

對(duì)正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施予240 min－1的起搏刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的熒光信號(hào)隨刺激規(guī)則性出現(xiàn)，無(wú)交替現(xiàn)象(圖2A)。經(jīng)缺氧處理0.25 h后，240 min－1的起搏刺激可使鈣瞬變現(xiàn)象強(qiáng)弱交替出現(xiàn)(圖2B)。此結(jié)果提示，在缺氧情況下，刺激更易誘發(fā)鈣瞬變交替。進(jìn)一步給心室肌細(xì)胞施予起搏頻率遞增2 min－1的刺激，結(jié)果顯示，缺氧組的心室肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣瞬變交替的閾刺激頻率顯著低于正常對(duì)照組的心室肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣瞬變交替的閾刺激頻率(P＜0.05)，見(jiàn)圖2C。

Figure 2.Effect of hypoxia on calcium transient alternations induced by rapid pacing in ventricular myocytes.Normal ventricular myocytes(A)and hypoxia－stimulated ventricular myocytes(B)were paced at a frequency of 240 min－1and calcium transient was detected.C:normal ventricular myocytes and hypoxia－stimulated ventricular myocytes were paced with increasing frequencies from 200 min－1to 300 min－1and the threshold was measured.±s.n=6.*P＜0.05 vs control.圖2 缺氧處理對(duì)快速起搏誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替的影響

3 輕度缺氧不改變心室肌細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步明確在缺氧誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替過(guò)程中是否存在細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的異常，本研究觀察了心室肌細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)變化。正常心室肌細(xì)胞呈棒狀，可見(jiàn)明顯的橫紋及橫小管結(jié)構(gòu)(圖3A)，而經(jīng)缺氧處理2.5 h后，雖然此時(shí)高頻起搏已經(jīng)能誘導(dǎo)鈣瞬變交替現(xiàn)象，但是心室肌細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯的改變，即細(xì)胞仍呈棒狀、細(xì)胞膜依然完整、橫紋和橫小管結(jié)構(gòu)依然規(guī)則(圖3B)。

Figure 3.Effect of hypoxia on ultrastructure of ventricular myocytes.A:control group;B:hypoxia group.圖3 缺氧處理對(duì)心室肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

4 持續(xù)的鈣瞬變交替誘導(dǎo)線粒體功能受損

心室肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理5 h后，線粒體的功能明顯降低，表現(xiàn)為線粒體脫氫酶的相對(duì)活性減弱。應(yīng)用維拉帕米(verapamil，VP)抑制L－型鈣通道，結(jié)果顯示，2.5 μmol/L VP在不影響線粒體功能的條件下，可明顯對(duì)抗缺氧誘導(dǎo)的線粒體功能受損，使線粒體脫氫酶的相對(duì)活性部分恢復(fù)，見(jiàn)圖4。

討論

鈣瞬變交替的現(xiàn)象最早是由 Lee等［11］在無(wú)意中將灌注心臟的灌流液關(guān)閉后發(fā)現(xiàn)的。近年來(lái)的研究表明，鈣瞬變交替可發(fā)生于心肌細(xì)胞的高頻起搏刺激、缺血/缺氧損傷以及酸中毒等病理生理?xiàng)l件下［8］。心室肌細(xì)胞的鈣瞬變交替是交替脈的電生理基礎(chǔ)，是惡性心律失常的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。因而，深入闡明心肌缺血對(duì)快速起搏誘導(dǎo)的鈣瞬變交替的影響，對(duì)于惡性心律失常的防治具有重要的臨床意義。

Figure 4.Effect of L－type Ca2+channel blocker on the decreased activity of mitochondrial dehydrogenase induced by hypoxia in ventricular myocytes.The ventricular myocytes suffered from hypoxia in the presence or absence of 2.5 μmol/L verapmil(VP)for 5 h，and then the relative activity of mitochondrial dehydrogenase was measured.±s.n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs hypoxia group.圖4 L－型鈣通道阻滯劑對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞線粒體脫氫酶活性降低的影響

心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離的 Ca2+交替通過(guò)影響Ca2+敏感的離子通道，如鈉－鈣交換體、L－型鈣通道以及鈣激活的氯通道等，引起動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)的改變。由于這些鈣敏感的離子通道對(duì)Ca2+的反應(yīng)各異，有的是使APD延長(zhǎng)，有的是使APD縮短，從而導(dǎo)致APD的交替性變化，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性心律失常的發(fā)生［4］?？焖倨鸩托募∪毖?缺氧均是鈣瞬變交替的重要影響因素，因此本研究首先在成年SD大鼠心室肌細(xì)胞觀察了快速起搏刺激對(duì)心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替的影響。結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)基中，低頻起搏可引起鈣瞬變現(xiàn)象，即心室肌細(xì)胞胞漿中的Ca2+含量隨著刺激而發(fā)生一致性改變。但是，當(dāng)快速起搏的頻率達(dá)到300 min－1時(shí)，心室肌細(xì)胞胞漿中的Ca2+含量的改變強(qiáng)弱交替出現(xiàn)，這說(shuō)明單獨(dú)快速起搏可誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞的鈣瞬變交替現(xiàn)象。這和本課題組前期在心房肌細(xì)胞上的研究結(jié)果類似［12］。

由于心肌缺血/缺氧也是引起惡性心律失常和心功能障礙的重要原因，因而，本研究接著觀察了缺氧對(duì)快速起搏引起心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替的影響。研究發(fā)現(xiàn)，240 min－1的快速起搏刺激對(duì)正常培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞的鈣瞬變無(wú)明顯影響，但是對(duì)缺氧的心室肌細(xì)胞可使其鈣瞬變的幅度強(qiáng)弱交替出現(xiàn)，提示缺氧可使快速起搏的心室肌細(xì)胞更容易發(fā)生鈣瞬變交替，即降低了快速起搏的刺激閾值。我們推測(cè)，臨床上心肌缺血時(shí)，心律失常容易發(fā)生的原因可能部分與此有關(guān)。此時(shí)，我們又通過(guò)顯微鏡照相發(fā)現(xiàn)，缺氧并未使心肌細(xì)胞橫紋及橫小管形態(tài)發(fā)生明顯改變，因而，認(rèn)為鈣瞬變交替的發(fā)生早于心肌細(xì)胞橫紋及橫小管形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，即在未發(fā)生上述細(xì)胞形態(tài)改變時(shí)，胞內(nèi)已經(jīng)存在鈣穩(wěn)態(tài)的異常。

在缺血/缺氧的情況下，心室肌細(xì)胞的能量代謝障礙，線粒體功能也發(fā)生不同程度的受損。另外，缺血/缺氧還會(huì)引起心室肌細(xì)胞的Ca2+敏感離子通道(如L－型鈣通道)功能和細(xì)胞內(nèi) Ca2+的水平變化［13］。有研究顯示，選擇性L－型鈣通道阻滯劑VP可以抑制鈣瞬變的發(fā)生，改善鈣穩(wěn)態(tài)失衡［14］。為此，本研究又觀察了鈣瞬變交替對(duì)缺氧引起的心室肌細(xì)胞線粒體功能的影響。研究結(jié)果顯示，缺氧處理可明顯降低心室肌細(xì)胞線粒體脫氫酶的活性，使其代謝WST－8產(chǎn)生黃色物質(zhì)的能力減弱。而給予VP可以部分恢復(fù)心肌細(xì)胞線粒體的功能，此結(jié)果提示，鈣瞬變交替可能介導(dǎo)了持續(xù)缺氧誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞線粒體功能受損和心功能障礙，Katra等［14］在豚鼠心臟上的研究支持本文的結(jié)果。

總之，本文在成年SD大鼠心室肌細(xì)胞觀察到缺氧可以易化快速起搏刺激誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替，而鈣瞬變交替又介導(dǎo)了持續(xù)缺氧誘導(dǎo)的線粒體功能受損。本文的研究結(jié)果為以缺氧為靶點(diǎn)的惡性心律失常和心功能障礙的防治提供了基礎(chǔ)資料。

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