張 猛， 張秋生， 林恒州， 紀(jì) 濤， 梁世杰， 李維平△

(1廣州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣東廣州510182;2深圳市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東深圳518035)

垂體瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤之一，其發(fā)生率中僅次于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦膜瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10%～15%。但尸體解剖中垂體瘤發(fā)現(xiàn)率可達(dá)10%～30%。由于腫瘤的局部壓迫、垂體激素分泌紊亂而表現(xiàn)出一系列的臨床癥狀和體征，嚴(yán)重影響人類的健康，同時也是不孕的重要原因之一。垂體患者的生活質(zhì)量明顯降低。垂體瘤目前具體發(fā)病機制尚未明了。動物模型是研究腫瘤發(fā)病機制及治療作用的重要工具。雌激素誘發(fā)大鼠垂體瘤模型普遍為泌乳素腺瘤，在免疫組化和內(nèi)分泌上與人垂體泌乳素瘤相似，外周血催乳素(prolactin，PRL)均顯著升高，且有成模快、確切等優(yōu)點，常被用于垂體瘤發(fā)病機制及藥物療效等研究。本項研究擬于Wistar－Furth大鼠腹腔內(nèi)注射溶于滅菌花生油(arachis oil，AO)的己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)誘導(dǎo)垂體瘤發(fā)生，并設(shè)立滅菌花生油注射及假注射組作為對照，觀察注射后不同時間內(nèi)Wistar－Furth大鼠行為學(xué)、垂體形態(tài)學(xué)及組織學(xué)變化，免疫組化法對成瘤細(xì)胞分型，并對比各組不同時點組織中CD31的表達(dá)，構(gòu)建合格的垂體瘤動物模型，為后繼研究提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物

Wistar－Furth大鼠(購自中山大學(xué)動物實驗中心)60只，體重60～80 g，雌雄不拘。所有動物于常溫、恒濕(55% ± 5%)、明暗交替光照環(huán)境(12/12)飼養(yǎng)，投清潔級標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲用純凈水。本實驗所涉及動物的處理均經(jīng)過深圳市第二人民醫(yī)院(深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院)倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑

二乙基己烯雌酚(Sigma)，抗PRL多克隆抗體(Abcam)，抗生長激素(growth hormone，GH)多克隆抗體(Abcam)，抗促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)多克隆抗體(Abcam)，抗CD31抗體(Abcam)，3，3'－二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(3，3'－diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋，ZLI－9048)，10%水合氯醛(深圳市兒童醫(yī)院試劑室)，滅菌花生油(山東魯花;由深圳市第二人民醫(yī)院供應(yīng)室以環(huán)氧乙烷法滅菌)。

3 主要方法

3.1 動物分組及處理 隨機分3組:DES組、AO組及對照組(control)。注射前分別稱重。DES組腹腔內(nèi)注射5 mg/kg DES溶液，AO組注射等量花生油，對照組僅穿刺不注射，3組均為2次/周。處理后按設(shè)計條件飼養(yǎng)，分別于4周、8周及12周隨機處死，見表1。

表1 實驗動物分組情況Table 1 .Group assignment of experimental animals

3.2 行為學(xué)觀察 動物每2 d于Moris水迷宮中進(jìn)行行為學(xué)觀察20 min，同時觀察體毛變化、體重和進(jìn)食情況。

3.3 標(biāo)本留取與保存 按照設(shè)定時點分別對實驗大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，心臟穿刺取血約2 mL備用。等速灌注4%多聚甲醛PBS液后，緊貼枕骨大孔處離斷大鼠頭顱，用血管鉗自枕骨大孔逐塊咬除枕骨、頂骨和額骨，剪斷顱底血管、神經(jīng)，將鼠腦翻向腹側(cè)，手術(shù)顯微鏡下觀察垂體組織與周圍結(jié)構(gòu)的關(guān)系，觀察垂體有無卒中。垂體稱重后于4%多聚甲醛PBS內(nèi)固定。

3.4 血清PRL濃度測定 鼠血經(jīng)3 000 r/min離心15 min分離血清，按放免測定試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)程序測定血清PRL濃度。

3.5 病理與免疫組織化學(xué)檢查 常規(guī)石蠟包埋組織，切片(厚4～5 μm)，HE染色后高倍鏡下觀察腺垂體組織的形態(tài)學(xué)改變情況，以確定垂體瘤發(fā)生與否。垂體瘤誘發(fā)率=(誘發(fā)數(shù)/實驗數(shù))×100%。

切片常規(guī)脫水后行免疫組化檢測。采用免疫組化染色步驟二步法:備用切片，用0.01 mol/L PBS水化3 min。3%甲醇－雙氧水室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min×3次。0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液高壓鍋加熱到126～130℃，抗原修復(fù)4 min，自然冷卻至室溫。0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min×3次。滴加Ⅰ抗(抗PRL、抗ACTH、抗GH及抗CD31抗體)，0.01 mol/L PBS緩沖液作為稀釋液4℃冰箱過夜。0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗IgG(PV－6000)工作液，37℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min。0.01 mol/L PBS緩沖液洗2 min×3次。DAB顯色劑顯色5 min，自來水終止顯色。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替Ⅰ抗進(jìn)行上述染色作為空白對照。

隨機5個高倍鏡下觀察DAB陽性細(xì)胞比例并求均值，按照陽性細(xì)胞比例進(jìn)行分級:＜25%為I級，25%～50%為II級，50%～75%為III級，＞75%為IV級。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1 行為學(xué)、一般表現(xiàn)及體重變化

處理后10 d左右，DES組部分大鼠出現(xiàn)行走緩慢，食欲不振，但未見出現(xiàn)明顯神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失表現(xiàn)。Moris水迷宮觀察3組大鼠之間無明顯差異。約第3周開始，DES組大鼠毛發(fā)光澤較其余2組變暗，并逐漸出現(xiàn)脫毛，以軀干最為明顯。DES組在11周死亡2只，其余均大鼠存活至相應(yīng)處死時點。

在實驗進(jìn)行過程中，3組大鼠體重均有不同程度的增長，但DES組大鼠體重增長速度在第2周后較其余2組明顯減慢(P＜0.01)，AO組及對照組體重增長速度無明顯差異，見圖1。

Figure 1.Body weight changes in rats of each group.±s.n= 10.DES:diethylstilbestrol;AO:arachis oil.圖1 不同時點3組大鼠體重變化情況

2 大鼠垂體重量及血清泌乳素變化

第4周DES組垂體平均重量較AO組及對照組略高，第8周及第12周DES組垂體平均重量較AO組及對照組明顯升高。血清PRL平均值在第4周后DES組較AO組及對照組均明顯升高。平均垂體重量及血清PRL在AO組及對照組間無明顯差異，見表2。

表2 不同處死時間點各組大鼠垂體重量及血清泌乳素水平Table 2 .The weight(mg)of rat pituitary gland and the serum prolactin level(μg/L)in each group at different time points(±s.n =15)

表2 不同處死時間點各組大鼠垂體重量及血清泌乳素水平Table 2 .The weight(mg)of rat pituitary gland and the serum prolactin level(μg/L)in each group at different time points(±s.n =15)

＊＊P＜0.01 vs AO or control.

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3 成瘤情況大體及HE染色觀察結(jié)果

第4周DES組有30%(3/10)大鼠垂體組織出現(xiàn)了瘤樣改變。大體表現(xiàn)為垂體體積較AO組及對照組增大，但表面色澤無明顯變化。光鏡HE染色表現(xiàn)為腺垂體側(cè)翼靠近其邊緣的部分瘤樣細(xì)胞的形成和原有的腺管樣結(jié)構(gòu)消失，未見出血或淋巴細(xì)胞浸潤。第8周DES組有90%(9/10)出現(xiàn)瘤樣改變。大體表現(xiàn)為垂體體積較AO組及對照組顯著增大，顏色較AO組及對照組深，呈暗紅色，部分腫瘤包膜下有血。光鏡下HE染色見細(xì)胞數(shù)目增多明顯，細(xì)胞呈圓形或多角形，胞漿帶增寬，核大小不一，深染，有核異型性，腫瘤充血并可見新生血管，腺管樣結(jié)構(gòu)呈總體消失狀態(tài)。第12周DES組100%(8/8)出現(xiàn)瘤樣改變，垂體大小較AO組及對照組顯著增大，并見瘤內(nèi)出血表現(xiàn)。另外，第11周DES組意外死亡2只大鼠(均為雌性)，大體及光鏡下表現(xiàn)同第12周處死的大鼠。未形成腫瘤的DES組大鼠垂體切片可見有少量的新生血管，但未見明顯瘤樣細(xì)胞及核異形。

DES組第4周處死的大鼠中，成瘤鼠3只均為雌性，第8周處死的大鼠中，成瘤鼠有5只為雌性，第12周處死的大鼠中，成瘤鼠有3只為雌性，但第11周意外死亡的2只均成瘤，且為雌性。Fisher確切概率檢驗結(jié)果顯示，P＞0.05，提示雌雄之間總體成瘤情況無明顯差異，見表3。

在第4周、第8周及第12周處死的AO組及對照組大鼠垂體未見相應(yīng)改變。垂體色澤均呈灰白色，光鏡下HE染色見細(xì)胞呈均勻圓形，未見異常形態(tài)細(xì)胞、核異形及新生血管。

表3 DES組雌雄大鼠成瘤情況對比Table 3 .Pituitary tumor incidence of male and female rats in DES group

4 免疫組化分析腫瘤類型

分別使用3種抗垂體激素抗體通過免疫組織化學(xué)法對腫瘤細(xì)胞類型進(jìn)行了鑒定。與AO組及對照組相比，DES組垂體瘤樣變化部位細(xì)胞表現(xiàn)為PRL陽性，部分可見散在的ACTH陽性細(xì)胞分布，見圖2;而GH無明顯表達(dá)。第4周及第8周DES組未形成腫瘤的垂體組織部分細(xì)胞仍可見較高PRL表達(dá)，見圖3。

Figure 2.Rat pituitary tissue in DES group(immunohistochemical staining，×400).Red arrows show a small amount of anti－ACTH positive cells.圖2 DES組大鼠垂體的抗ACTH免疫組化染色

Figure 3.Pituitary tissues of rats sacrificed at 12 weeks in AO group and rats sacrificed at 4 weeks，8 weeks，and 12 weeks in DES group(immunohistochemistry with anti－PRL，×400).A:AO Group at 12 weeks;B:DES group at 4 weeks;C:DES group at 8 weeks;D:DES group at 12 weeks.圖3 于12周處死的AO組大鼠及4周、8周和12周處死的DES組大鼠垂體組織抗PRL免疫組化染色

5 成瘤過程中CD31表達(dá)的動態(tài)變化

高倍鏡下，AO組及對照組大鼠垂體組織僅胞漿中有少量CD31表達(dá)，而在有瘤樣改變的垂體組織中，CD31陽性表達(dá)見于增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁及瘤樣改變的細(xì)胞中，實體區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞則未見有CD31陽性表達(dá)。DES組大鼠未成瘤垂體在增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁中可見有CD31陽性較高表達(dá)，見圖4。

Figure 4.The expression of CD31 in rat pituitary tissues from different groups.The proportion of DAB－positive cells less than 25% is grade I，25%～50%is grade II，50%～75%is grade III，and large than 75%is grade IV.圖4 各時段不同組別大鼠垂體組織中CD31的表達(dá)情況

討論

1 垂體瘤動物模型研究現(xiàn)狀

泌乳素腺瘤是發(fā)生于垂體前葉泌乳素上皮細(xì)胞的腫瘤，在各種垂體瘤中，泌乳素腺瘤發(fā)生率高達(dá)60%。盡管采用藥物、放射治療和外科治療干預(yù)，其復(fù)發(fā)率仍較高［1］。由于垂體的特殊性，正常垂體難以獲得，所以人們建立了多種垂體瘤動物模型，以研究垂體瘤的病理發(fā)生和藥物作用機制。這些模型包括以下4種(1)動物自發(fā)性垂體瘤模型:與動物的種系、性別和年齡有關(guān)。其優(yōu)點是腫瘤的生物學(xué)特性與人類垂體瘤的生物學(xué)特性很相像，但存在的缺點也很明顯，包括獲得成模時間長，效果不確切;腫瘤體積普遍較小，位置深在，不便于觀察，荷瘤動物容易死亡等。(2)雌激素誘導(dǎo)動物垂體瘤模型:其具體機制未完全明了，但文獻(xiàn)報道與種屬有關(guān)，如Fischer344大鼠接受長期雌激素，幾周后其腺體異常增長成瘤，質(zhì)量達(dá)到正常垂體質(zhì)量10～20倍。其它敏感的大鼠品系還有AxC－Irish(ACI)、Wistar－Furth大鼠和Copenhagen (COP)品系。相反，Holtzman、Sprague－Dawley和 Brown－Norway大鼠長期給予雌激素后，其垂體質(zhì)量仍維持正常。雌激素誘發(fā)大鼠垂體瘤模型普遍為PRL腺瘤，且在免疫組化和內(nèi)分泌上與人垂體泌乳素瘤相似，外周血PRL均顯著升高。且有成?？?、確切等優(yōu)點。但其缺點包括部分表現(xiàn)出對雌激素依賴，成瘤種類單一，絕大多數(shù)為泌乳素瘤，僅少部分為混合型腺瘤。(3)移植性垂體瘤模型:按被移植瘤的來源可分為3種:自發(fā)性可移植性垂體瘤動物模型、誘發(fā)性可移植性垂體瘤動物模型和人類可移植性垂體瘤動物模型。按移植部位分為皮下移植、腎囊內(nèi)移植和顱內(nèi)移植。但這種模型和人類PRL瘤有些區(qū)別:生長過快、分泌多種激素和惡性特征等缺點。(4)轉(zhuǎn)基因垂體瘤動物模型:這種模型可以通過對特定靶基因編譯，可以誘發(fā)相應(yīng)類型的垂體腺瘤，但技術(shù)要求高，成本高，不利于廣泛開展［2－8］。

雌激素誘導(dǎo)動物垂體瘤模型，其機制可能與雌激素/ERα受體調(diào)節(jié)基因有關(guān)。另外，有報道認(rèn)為雌激素通過調(diào)節(jié)垂體泌乳素細(xì)胞中多巴胺激活的GIRK通道，從而達(dá)到調(diào)節(jié)泌乳素釋放的機制［9－10］。本實驗系采用腹腔注射雌激素的方法誘導(dǎo)大鼠垂體腺瘤形成，較既往報道的皮下埋置雌激素緩釋膠管方法簡單，沒有皮下切口及異物，成瘤率穩(wěn)定，在模型形成過程中，血清泌乳素及部分生化指標(biāo)能出現(xiàn)動態(tài)的變化，很好地模擬了人體垂體瘤形成的過程，能為垂體瘤發(fā)病機制的研究及后繼的治療研究提供一個穩(wěn)定的動物模型。但仍是局限于泌乳素腺瘤，部分ACTH陽性表達(dá)，可能與內(nèi)環(huán)境的改變有關(guān)。如何建立不同激素表達(dá)類型的垂體瘤動物模型，仍有待更進(jìn)一步的深入研究。

2 雌激素誘導(dǎo)大鼠垂體瘤成瘤過程中體重增長速度變化

體重增長減慢是己烯雌酚誘導(dǎo)大鼠泌乳素腺瘤形成過程中的表觀參數(shù)之一，本研究中，DES組體重增長速度較AO及對照組明顯下降。有報道在高表達(dá)DES－acyl ghrelin的轉(zhuǎn)基因小鼠中，ghrelin的正常表達(dá)受阻，不能有效刺激GH細(xì)胞，從而導(dǎo)致生長素分泌減少，血清中IGF－1明顯下降，同時體重減輕，體長明顯下降［11］，因此DES誘導(dǎo)垂體瘤大鼠體重增長緩慢可能與泌乳素腺瘤細(xì)胞生長過程中生長素細(xì)胞數(shù)量下降，生長素分泌不足有關(guān)。但DES組體重增長減慢的幅度較大多數(shù)文獻(xiàn)報道的要低，可能與分次腹腔內(nèi)注射己烯雌酚，血藥濃度未能像皮下埋置緩釋膠管那樣形成穩(wěn)態(tài)高濃度的刺激。但臨床上垂體泌乳素瘤發(fā)生亦是在較高水平雌激素作用下長期緩慢演進(jìn)的過程，因此本實驗所用方法可能更符合這種實際情況。

3 性別對雌激素誘導(dǎo)大鼠垂體瘤的影響

本組實驗設(shè)計時性別采用隨機方法，但DES組中無論雌性還是雄性大鼠，在處理4周后，無論是否形成瘤樣組織，垂體組織均可見新生血管，CD31表達(dá)陽性率亦較AO及對照組高。最終形成瘤樣組織大鼠在性別上并無明顯差異。但雄性大鼠形成瘤樣組織較雌性時間長，且DES組中雌性大鼠相同時點PRL較雄性大鼠高，可能與雌性大鼠PRL儲備較高，在實驗過程中大量釋放有關(guān)［12］。

4 CD31在垂體瘤發(fā)生及生長過程中的作用

CD31是免疫球蛋白超家族中的細(xì)胞黏附分子，為130 kD的跨膜糖蛋白，主要分布在血管細(xì)胞上。報道證實培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接處CD31有高水平表達(dá)［13］?？笴D31抗體能夠阻斷正常內(nèi)皮細(xì)胞間連接并影響細(xì)胞遷移，從而導(dǎo)致新生血管生成減少，表明他們在血管增生和損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，并可作為內(nèi)皮細(xì)胞特異的標(biāo)記物，對腫瘤的微血管進(jìn)行計數(shù)。有文獻(xiàn)報道在正常垂體組織中，CD31表達(dá)顯著低于手術(shù)取得的垂體瘤組織［14］。另有研究對照復(fù)發(fā)垂體瘤患者組織及未復(fù)發(fā)患者組織發(fā)現(xiàn)，所有垂體瘤組織中均有CD31表達(dá)，但復(fù)發(fā)組陽性血管數(shù)明顯高于未復(fù)發(fā)組，且復(fù)發(fā)組的CD31染色強度明顯高于未復(fù)發(fā)組。本研究中檢測到DES組垂體組織中(成瘤或未成瘤)，CD31在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁以及血管周邊瘤樣細(xì)胞中表達(dá)，說明CD31在血管內(nèi)皮增生以及瘤細(xì)胞增殖過程中均有可能發(fā)揮作用。

本實驗可以證實，腹腔內(nèi)分次注射己烯雌酚在12周左右，可以明確誘導(dǎo)Wistar－Furth大鼠形成垂體瘤，成瘤率可達(dá)100%，且腫瘤形成穩(wěn)定，方法簡便。另外，在成瘤過程中，部分指標(biāo)如PRL、CD31等均表現(xiàn)出動態(tài)變化，可在垂體瘤病因、發(fā)病機制、臨床治療、藥物開發(fā)與研制中發(fā)揮重要作用。

［1］ Palaoglu S，Sungur A，Cila A，et al.Diethylstilbestrolinduced prolactinoma:dose－related tumor growth and effect of catecholaminergic cells on prolactin tumor cells［J］.Surg Neurol，2005，64(Suppl 2):S42－S47.

［2］ Pandey J，Bannout A，Wendell DL，et al.The Edpm5 locus prevents the‘a(chǎn)ngiogenic switch’in anestrogen－induced rat pituitary tumor［J］.Carcinogenesis，2004，25 (10):1829－1838.

［3］ Daniel L，Trouillas J，Renaud W，et al.Polysialylatedneural cell adhesion molecule expression in rat pituitary transplantable tumors(spontaneous mammotropic transplantable tumor in Wistar－Furth rats is related to growth rate and malignancy［J］.Cancer Res，2000，60(1):80－85.

［4］ Heaney AP，F(xiàn)emando M，Melmed S.PPAR－γ receptor ligands:novel therapy for pituitary adenomas［J］.Clin Invest，2003，111(9):1381－1388.

［5］ Paez－Pereda M，Kovalovsky D，Hopfner U，et al.Retinoic acid prevents experimental Cushing syndrome［J］.Clin Invest，2001，108(8):1123－1131.

［6］ Fedele M，Battista S，Kenyon L，et al.Overexpression of the HMGA2 gene in transgenic mice leads to the onset of pituitary adenomas［J］.Oncogene，2002，21(20):3190－3198.

［7］ Pernasetti F，Spady TJ，Hall SB，et al.Pituitary tumorigenesis targeted by the ovine follicle－stimulating hormone beta－subunit gene regulatory region in transgenic mice［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，203(1－2):169－183.

［8］ Tascou S，Trappe R，Nayernia K，et al.TSPY－LTA transgenic mice develop endocrine tumors of the pituitary and adrenal gland［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，200 (1－2):9－18.

［9］ Kim HJ，Gieske MC，Trudgen KL，et al.Identification of estradiol/ERα－regulated genes in the mouse pituitary［J］.J Endocrinol，2011，210(3):309－321.

［10］ Christensen HR，Zeng Q，Murawsky MK，et al.Estrogen regulation of the dopamine－activated GIRK channel in pituitary lactotrophs:implications for regulation of prolactin release during the estrous cycle［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，301(3):R746－R756.

［11］ Ariyasu H，Takaya K，Iwakura H，et al.Transgenic mice overexpressing des－acyl ghrelin show small henotype［J］.Endocrinology，2005，146(1):355－364.

［12］ Cruz－Soto ME，Scheiber MD，Gregerson KA，et al.Pituitary tumorigenesis in prolactin gene－disrupted mice［J］.Endocrinology，2002，143(11):4429－4436.

［13］ DeLisser KH，Christofidou－Solomidou M，Strierter RM，et al.Involvement of endothelial PECAM/CD31 in angiogenesis［J］.Am J Pathol，1997，151(3):671－674.

［14］ Helen ET，Zsusha N，Kevin CG，et al.Angiogenesis in pituitary adenomas and the normal pituitary gland［J］.Clin Endocrinol Metab，2000，85(3):1159－1162.