趙玉玲，馬曉光，李 輝，徐吉英，閆國蕊，石 潔

河南省疾病預防控制中心結核病預防控制所鄭州450016

#通訊作者，女，1965年5月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向:結核、HIV雙重感染，E-mail:xjy3115@sohu.com

結核病是引起人類感染性疾病和死亡的主要原因，采用遺傳標志物對結核分枝桿菌進行基因分型的研究［1］結果證實應用不同的基因分型方法可以將結核分枝桿菌的流行確定為主要是由幾種特殊的基因型家族引起的，而且不同的基因型家族具有獨特的分子特征、地域分布差異和致病性等。該研究運用RD105缺失基因檢測法及常用的結核分枝桿菌分型技術可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(variable number tandem repeats analysis，VNTR)［2-5］對河南省尉氏縣2009至2011年間的257株臨床分離的結核分枝桿菌菌株進行基因分型，并應用比例法進行藥敏試驗，以了解北京家族基因型在該地區(qū)的分布情況，VNTR基因型分布特征和流行情況以及不同基因型與耐藥性之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 所有菌株均來自于河南省尉氏縣結核病防治機構2009年6月至2011年6月“結核病傳播模式研究”項目中的臨床患者痰標本，用羅氏培養(yǎng)基常規(guī)分離培養(yǎng)結核分枝桿菌，獲得陽性培養(yǎng)物。標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供，作為該次試驗的對照菌株。

1.2 菌株DNA的制備 將收集到的痰標本經(jīng)40 g/L NaOH前處理后接種于酸性L-J培養(yǎng)基，37℃孵育培養(yǎng)2～4周，至有菌落生長，取一菌環(huán)菌溶于500μL TE(pH 8.0)中，80℃30 min水浴滅活，在旋渦振蕩器上振蕩至塊狀菌落均勻溶于TE中，沸水煮沸10min，12 000 r/min離心2min，取上清備用(－20℃冷凍保存)。

1.3 7個結核分枝桿菌VNTR的基因位點分型

1.3.1 位點的選擇 根據(jù)文獻［6］的報道篩選7個VNTR基因位點(表1)。PCR Mix均由北京康為世紀公司合成生產(chǎn)。

表1 位點名稱與引物序列

1.3.2 VNTR-PCR 采用20μL PCR反應體系: 19μL PCR Mix，被檢DNA模板1μL。VNTR3820的PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃ 1.5 min，25個循環(huán);72℃延伸7 min。Qub11b、Qub11a、Qub26、Qub18、Mtub21、MIRU26的PCR反應條件:94℃預變性1 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠恒電壓(5 V/cm)電泳，用Quantity one分析軟件分析各PCR擴增產(chǎn)物大小并計算出各菌株的重復次數(shù)。

1.4 北京家族基因型的鑒定 采用RD105缺失基因檢測法［7］。引物序列設計參照文獻［7］，每個PCR管中加入19μL PCR Mix，1μL DNA模板。擴增條件:94℃預變性5 min;94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，有786 bp大小產(chǎn)物出現(xiàn)鑒定為北京家族基因型。

1.5 耐藥性鑒定 根據(jù)“結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程”［8］進行菌種鑒定。采用比例法對317株菌進行異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)4種藥的藥敏試驗，4種藥物在羅氏培養(yǎng)基中的終質量濃度分別為0.2、40.0、2.0和4.0 mg/L，以耐藥百分比＞1%為陽性。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。應用BioNumberics 5.0軟件對菌株進行7個VNTR基因位點鑒定結果的聚類分析，應用χ2檢驗比較北京家族基因型與非北京家族基因型菌株主要流行與非主要流行菌群耐藥性的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 北京家族基因型的鑒定結果 257株結核分枝桿菌中有233株(90.7%)鑒定為北京家族基因型菌株，其余24株(9.3%)為非北京家族基因型結核分枝桿菌菌株。見圖1。

圖1 結核分枝桿菌北京家族基因型鑒定結果1～5，7～8，10～12:北京家族基因型;6，9:非北京家族基因型;M:Marker。

2.2 7個VNTR基因位點分型結果的聚類分析257株結核分枝桿菌共230個基因型，參考文獻［4］的方法，分為4個基因群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ群)。其中Ⅰ群有8個基因型(3.1%);Ⅱ群有79個基因型(30.7%);Ⅲ群有152個基因型(59.1%);Ⅳ群有18個基因型(7.0%)。

2.3 257株結核分枝桿菌藥物敏感性結果 257株結核分枝桿菌中，75.5%(194/257)的菌株表現(xiàn)為全敏感，而24.5%(63/257)的菌株表現(xiàn)為耐藥;其中耐多藥結核分枝桿菌菌株占8.9%(23/257)。在北京家族基因型中，23.2%(54/233)的菌株為耐藥株;而非北京家族基因型中，37.5%(9/24)的菌株為耐藥株(χ2=2.412，P=0.120)。在主要流行Ⅲ群中27.6%(42/152)的菌株表現(xiàn)為耐藥，而其他非主要流行群(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ群)中20.0%(21/105)的菌株表現(xiàn)為耐藥(χ2=1.954，P=0.162)。

3 討論

尉氏縣地處豫東平原，2009年6月至2011年6月從該縣結核病防治機構收治的結核病患者中分離的257株結核分枝桿菌具有一定的代表性，可用于分析該地區(qū)的結核病流行菌株的情況。

隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，DNA分型鑒定技術被廣泛地應用于結核病的流行病學研究領域。該研究應用7個VNTR基因位點的分型方法，得到了明確的數(shù)字化分型結果，結核分枝桿菌基因分型為14/5/8/5/8/8/5的菌株在研究中有6株，可能是該地區(qū)的優(yōu)勢傳播菌株。在3對成簇的菌株中，其中一對菌株的來源患者經(jīng)流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)有較為明確的接觸史，且其一為復發(fā)的結核患者，提示可能為同一菌株的傳播所致。對其余成簇的菌株可增加其余9位點VNTR分型，如果9位點仍然全部一致，則需要再進行進一步的分型鑒定。

北京家族基因型菌株分布于整個亞洲地區(qū)［9］，在中國北京地區(qū)最常見，曾造成多次暴發(fā)流行［2］。該研究鑒定為北京家族基因型233株，占全部257株菌株的90.7%。這一比例高于2006年全國的平均水平(64.9%)［10］。可能因該研究中的入選樣本量不是太大。

該研究鑒定出的耐多藥結核分枝桿菌占8.9%，這一比例低于2000年全國平均水平(10.7%)［4］，與2007年全國結核病調(diào)查的耐多藥率8.3%［10］基本一致。該研究北京家族基因型與非北京家族基因型菌株、主要流行(Ⅳ)群與非主要流行(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ)群菌株中耐藥株的分布差異無統(tǒng)計學意義，提示基因型的分型與耐藥間無明顯關聯(lián)。

［1］柳正衛(wèi)，呂冰，王曉萌，等.71株浙江省結核分枝桿菌臨床分離株MLVA基因分型研究［J］.中國預防醫(yī)學雜志，2008，9(12):1017

［2］Van Soolingen D，Qian L，de Haas PE，et al.Predominance of a single genotype ofMycobacterium tuberculosis in countries ofeast Asia［J］.JClin Microbiol，1995，33(12):3234

［3］全國結核病流行病學抽樣調(diào)查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調(diào)查報告［J］.中國防癆雜志，2002，24(2):65

［4］許衛(wèi)國，虞浩，楊丹丹，等.數(shù)目可變串聯(lián)重復序列用于江蘇省168株結核分枝桿菌菌株的基因分型研究［J］.南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2007，27(12):1509

［5］Cowan LS，Mosher L，Diem L，et al.Varial-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units［J］.J Clin Microbiol，2002，40 (5):1592

［6］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，etal.Deciphering the biology of Mycobacterium.Tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393(6685):537

［7］吳長東，米利古，龔天美，等.RD105缺失基因檢測法用于結核分枝桿菌新疆“北京家族”臨床分離株的鑒定［J］.中國病原生物學雜志，2010，5(3):161

［8］中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會.結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程［M］.北京:中國教育文化出版社，2006:46

［9］Glynn JR，Whiteley J，Bifani PJ，et al.Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculsis:a systematic review［J］.2002，8(8):843

［10］European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis.Beijing/W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance［J］.Emerg Infect Dis，2006，12(5):736