何文強，尹繼云，孟 曉，王梅葉，張文濤，曲憲東，李南南

武警河南總隊醫(yī)院泌尿外科鄭州450052

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1-2］，目前主要采用手術、放療和化療等手段治療，但是治療后極易復發(fā)和進展，預后較差。近年來分子靶向治療作為綜合治療的一個重要手段和新興治療模式在臨床中受到越來越多的關注，因此尋找治療膀胱癌的分子靶點具有十分重要的意義。Pim-3激酶是前病毒整合位點莫羅尼鼠白血病病毒家族的成員之一，屬于鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶成員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性［3］。作者利用RNA干擾技術下調(diào)膀胱癌T24細胞中Pim-3的表達，研究其對膀胱癌細胞增殖和細胞周期分布的影響，并分析其可能的分子機制，旨在為以Pim-3為靶點的膀胱癌基因治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 膀胱癌T24細胞購自上海川翔生物科技有限公司;胰蛋白酶和RPMI 1640購自美國Gibco公司、小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;脂質(zhì)體LipofectaminTM2000購自美國Invitrogen公司;CCK-8購自上海碧云天生物技術有限公司;Pim-3小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、對照siRNA、兔抗人多克隆抗體Pim-3、Cyclin D1、Cdk2和P21均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將膀胱癌T24細胞復蘇后培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細胞分為3組:未處理組(不作任何處理)、對照siRNA組(采用50 nmol/L對照siRNA轉(zhuǎn)染)和Pim-3 siRNA組(利用50 nmol/L Pim-3 siRNA轉(zhuǎn)染)。當T24細胞達到90%左右融合時，按照脂質(zhì)體LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明將Pim-3 siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)入T24細胞。

1.3 Western blot檢測 Pim-3、CyclinD1、Cdk2 和P21蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后48 h的膀胱癌T24細胞，用細胞裂解液提取總蛋白，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，取下凝膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST液封閉NC膜2 h，加入 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 和 β-actin 一抗(均稀釋200倍)，4℃搖床過夜孵育。第2天加入二抗室溫孵育2 h。將NC膜置于增強化學發(fā)光試劑ECL中反應1～3 min，于暗室中利用X射線曝光，常規(guī)方法顯影定影，顯示特異的蛋白信號。蛋白表達的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，以目的基因與內(nèi)參β-actin基因灰度值的比值表示蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.4 細胞增殖速率檢測 分別收集轉(zhuǎn)染后的24、48、72和96 h的膀胱癌T24細胞，當測定增殖速率時，加入終濃度為體積分數(shù)10%的CCK-8試劑，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后于酶標儀上測定450 nm的吸光度。

1.5 細胞周期檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h的膀胱癌T24細胞約1×106個。利用PBS緩沖液漂洗細胞，并置于4℃、體積分數(shù)70%的冰乙醇中固定30 min，采用冷PBS漂洗3次，然后將細胞重懸于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNase A的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。最后采用流式細胞儀檢測樣品中G0/G1、S和G2/M期細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0分析，3組膀胱癌 T24 細胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達，細胞增殖速率和細胞分布周期的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組膀胱癌 T24細胞中 Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21蛋白的表達 見圖1、表1。

圖1 3組膀胱癌T24細胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達

表1 3組膀胱癌T24細胞中Pim-3、Cyclin D1、Cdk2、P21 蛋白的表達(n=3)

2.2 3組膀胱癌T24細胞的增殖速率 見表2。

表2 3組膀胱癌T24細胞的增殖速率(n=5)

2.3 3組膀胱癌T24細胞周期分布 見表3。

表3 3組膀胱癌T24細胞周期分布(n=3)%

3 討論

研究［4-8］表明，原癌基因 Pim-3在腫瘤中的過表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Pim-3在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃黏膜組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和靜脈轉(zhuǎn)移密切相關［9］。Pim-3 mRNA和蛋白在所有的胰腺癌細胞系中都有表達，并且和前凋亡蛋白Bad共同發(fā)揮作用［6］。以上研究提示Pim-3的高表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，進一步阻斷Pim-3可能成為腫瘤分子靶向治療的一個十分重要的靶點。該研究結(jié)果顯示，Pim-3 siRNA轉(zhuǎn)染后48 h顯著下調(diào)了T24細胞中Pim-3蛋白的表達，為后續(xù)進一步研究Pim-3的功能提供理論依據(jù)。

目前，許多研究［7，10-11］表明，Pim-3 shRNA 處理后在體外通過增加不同類型的腫瘤細胞(包括結(jié)腸癌、肝癌和胰腺癌)的凋亡而抑制腫瘤細胞的增殖。與野生型的小鼠相比，采用二乙基亞硝氨(一種潛在的肝癌誘導劑)處理Pim-3的轉(zhuǎn)基因小鼠，在早期能加速肝細胞的增殖［5］。此外，所有的Pim激酶家族成員均能結(jié)合蘇氨酸殘基處磷酸化Cdk抑制因子P27，誘導P27與14-3-3蛋白結(jié)合，導致細胞周期分布發(fā)生改變［12］。這些研究表明，Pim-3在腫瘤細胞增殖和細胞周期進程中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 Pim-3 siRNA后的48～96 h，膀胱癌T24細胞的增殖受到明顯的抑制。進一步流式細胞結(jié)果顯示，Pim-3表達下調(diào)能明顯誘導T24細胞周期靜止在G0/G1期，并降低S期細胞的比率，從而阻斷DNA的合成，進一步抑制細胞的增殖。因為細胞增殖抑制和細胞周期分布改變與細胞周期調(diào)控蛋白表達的變化密切相關，所以作者利用Western blot檢測與細胞增殖和細胞周期密切相關的Cyclin D1、Cdk2和P21蛋白的表達，結(jié)果表明，Pim-3表達下調(diào)能明顯下調(diào)Cyclin D1和Cdk2蛋白的表達，但上調(diào)P21蛋白的表達，提示Pim-3表達下調(diào)介導的增殖抑制和細胞周期靜止可能與上述細胞周期調(diào)控蛋白表達的變化密切相關，但是其詳細的分子機制尚需要進一步探討。

綜上所述，Pim-3 siRNA能有效下調(diào)膀胱癌細胞中Pim-3蛋白的表達，其表達下調(diào)明顯抑制細胞增殖和改變細胞周期的分布，可能與細胞周期調(diào)控蛋白表達的變化密切相關，進一步研究膀胱癌中Pim-3的功能有望為以Pim-3為靶點的膀胱癌基因治療提供新的理論依據(jù)。

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