尚迎輝，李 濤，白峻瑜，石聰聰，封青川，賀 穎，鄭 紅#

1)鄭州市市直機關醫(yī)院內(nèi)科鄭州450007 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室鄭州450001

血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib-Ⅸ復合物(GPIb-Ⅸ-Ⅴ)是血小板膜上主要的糖蛋白之一，由2分子GPIba亞單位、2分子 GPIb亞單位、2分子GPⅨ和1分子 GPⅤ組成。GPIba是 GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合物中最大的多肽，含有凝血酶高親和力結(jié)合位點，可在低凝血酶濃度時激活血小板，進而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、血栓栓塞的形成和血管痙攣等［1-2］。GPIba基因位于17號染色體短臂，具有高度多態(tài)性。編碼GPIba的基因序列的C/T多態(tài)性(ACG/ATG)導致位于vWF受體結(jié)合區(qū)的GPIba鏈第145殘基的Thr/Met(蘇氨酸/蛋氨酸)二態(tài)性，該區(qū)域富含亮氨酸，是人類血小板同種異體抗原2(HPA-2)分類的基礎，在145位蘇氨酸和蛋氨酸分別對應HPA-2a和HPA-2b［3-4］。該多態(tài)位點位于vWF受體結(jié)合區(qū)，可增強血小板的黏附作用，可能是腦卒中發(fā)病的遺傳危險因素［5-6］。作者應用PCR-RFLP方法對河南漢族436例動脈硬化性腦梗死(atherothrombotic brain infarction，ABI)患者進行GPIba HPA-2基因多態(tài)性檢測，探討該多態(tài)性與ABI的關系，為ABI的防治提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2004年12月至2006年6月河南省二甲以上醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的ABI患者436例，經(jīng)臨床檢查(病史、體征、生化檢驗、CT或MRI)確診，ABI的診斷參照第四屆腦血管會議修訂的診斷標準。患者中男280例，女156例，年齡(62.2±12.2)歲。正常對照選自同期健康體檢者549例，其中男313 例，女236例，年齡(62.6 ±12.2)歲。研究個體之間無血緣關系，均為河南漢族人群。排除患有心、腦血管疾病及肝、腎、內(nèi)分泌疾病者，所有患者均知情同意。

1.2 GPIba HPA-2基因多態(tài)性檢測 抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，用常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA，以此為模板，進行PCR擴增。PCR擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列5’-GGACGTCTCCTTCAACCGGC-3’，下 游 引 物 序 列 5’-GCTTTGGTGGGGAACTTGAC-3’，產(chǎn)物大小591 bp。PCR擴增體系:模板 DNA 2 μL，上、下游引物各 2 μL，2 × Taq PCR Master Mix 6 μL，去離子水補至25 μL。PCR 擴增條件:94℃預變性4 min;94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進行AcyI酶切反應，取8 μL酶切產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，對2組之間的基因型頻率及等位基因頻率的差異進行χ2檢驗，并計算比數(shù)比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1GPIba HPA-2基因多態(tài)性PCR-RFLP分型結(jié)果 見圖1。GPIba基因HPA-2多態(tài)位點PCR產(chǎn)物經(jīng)AcyⅠ酶切后，可有3個型別，產(chǎn)生270、201和120 bp 3個片段為a/a型;產(chǎn)生390、201 bp 2個片段為b/b型，產(chǎn)生120、201、270和390 bp 4個片段為a/b型。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 對照組基因型頻率的分布符合Hardy-weinberg平衡(χ2=0.019，P=0.650)，說明該樣本具有良好的人群代表性。

2.3 2組GPIba HPA-2基因型和等位基因頻率的比較 見表1?？梢钥闯觯珹BI組和對照組HPA-2基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義。

表1 2組GPIba HPA-2基因型及等位基因頻率的比較 例(%)

2.4 河南漢族人群GPIba HPA-2基因型頻率與其他人群的比較 見表2?？梢钥闯?，GPIba HPA-2多態(tài)性存在顯著的地域和種族差異。

表2 河南漢族人群GPIba HPA-2基因型頻率與其他人群的比較

3 討論

GPIb是血小板膜上含量最多的糖蛋白，每個血小板上有將近25 000個GPIb分子，是參與構(gòu)成血小板的主要黏附受體，在血栓形成中起重要作用［2］。

張彤等［12］對100例心肌梗死患者和104例無心臟病史的正常對照進行GPIba基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，HPA-2 a/b+b/b型的頻率與德國人和日本人報道的相似，并得出145Met等位基因(HPA-2b)與心肌梗死的發(fā)生顯著相關的結(jié)論(OR=2.2)，表明HPA-2b等位基因是心肌梗死發(fā)生的一個獨立危險因素。該研究結(jié)果證實，河南漢族人群中GPIba HPA-2存在3種基因型，而ABI與正常河南漢族人群中3種基因型和2個等位基因的頻率差異并無統(tǒng)計學意義，與張涌等［7］在腦血栓人群中的結(jié)果一致。該研究中b等位基因的頻率很低，HPA-2 b/b純合子僅在對照組中發(fā)現(xiàn)1例，推測與研究樣本量少有關，又或者這本身體現(xiàn)了中國北方漢族人群GPIba HPA-2多態(tài)性的特點，因此仍需擴大樣本量進行深入研究。

該研究結(jié)果還顯示，河南漢族人群HPA-2各基因型頻率分別為 89.6%(a/a)、0.2%(b/b)和10.2%(a/b)，與濟南地區(qū)人群中的頻率比較差異無統(tǒng)計學意義，表明近距離地理范圍內(nèi)漢族人群HPA-2各基因型頻率趨于一致;與同屬亞洲地區(qū)的印度人群相比，河南漢族人群HPA-2 a/a基因型頻率稍高，推測這種差異也可能與研究的樣本量較小有關;與高加索、美國白人和非洲人群比較，河南漢族人群HPA-2基因型頻率較高，a/b和b/b型頻率稍低，提示HPA-2多態(tài)性存在顯著的地域和種族差異，因此關于該多態(tài)性國內(nèi)外結(jié)論各異的報道，尚需要擴大樣本進一步研究驗證。

最近研究［13］表明GPIba的VNTR多態(tài)性可能與河南漢族人群ABI的發(fā)生有關;而HPA-2多態(tài)性與VNTR多態(tài)性之間存在連鎖不平衡，HPA-2a與VNTR的D和C多態(tài)連鎖，而HPA-2b則與B和A多態(tài)連鎖［9，14］。因此，對 HPA-2 與 VNTR 兩種多態(tài)性進行單體型分析，深入探討GPIba基因多態(tài)性及單體型與ABI的相關性，將有助于對ABI發(fā)病分子遺傳機制的認識。

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