孫鵬輝，梁守沛，陸?zhàn)┤?，?杰，王小龍，許 東，姚 武，吳逸明，周 舫

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州450001

肺癌是當(dāng)今世界上流行最廣、危害最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，已成為絕大多數(shù)國(guó)家癌癥死亡的首要病因，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。研究［1-2］表明，熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)在胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中均可高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療和預(yù)后過程中起著重要作用。另有研究［3］顯示，HSP70在肺癌細(xì)胞和組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，并與肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。作者從肺癌組織提取HSP70多肽復(fù)合物，分別以不同濃度、不同時(shí)間刺激肺腺癌A549細(xì)胞，觀察HSP70多肽復(fù)合物對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書后，實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1例肺腺癌患者行手術(shù)切除的肺腺癌組織。RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，MTT(Sigma公司)，ConA-Sepharose 4B親和層析凝膠(GE Healthcare公司)，鼠抗人HSP70單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，快速蛋白液相色譜純化系統(tǒng)(GE Healthcare公司)，JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。

1.2 肺組織HSP70多肽復(fù)合物的提取與純化 將收集到的肺癌組織研磨、裂解后收集組織總蛋白，進(jìn)行ConA-Sepharose 4B親和層析后，收集透析袋內(nèi)液體凍干濃縮，進(jìn)行DEAE離子交換層析，收集每個(gè)波峰產(chǎn)生的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的交換層析，將所得的樣品進(jìn)行真空凍干濃縮，增大樣品蛋白單位體積的濃度，然后采用 Western blot法進(jìn)行鑒定。

1.3 不同濃度HSP70多肽復(fù)合物作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 復(fù)蘇A549細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞生物研究所提供)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90%時(shí)用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳2代后可用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5 ×107L－1，以每孔 200 μL 接種于 96孔板(空白組只加入培養(yǎng)液)，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，吸棄原液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含 0.1、0.5、1.0、2.5 及 5.0 mg/L 的 HSP70 多肽復(fù)合物的培養(yǎng)液，空白組及對(duì)照組只加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別在24、48和72 h后將細(xì)胞取出，每孔中加入5 g/L的MTT染液20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，放入搖床中室溫震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各組在492 nm處的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 12.0處理數(shù)據(jù)，采用3×6析因設(shè)計(jì)的方差分析觀察HSP70多肽復(fù)合物濃度及作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1HSP70多肽復(fù)合物的提取、純化結(jié)果 經(jīng)ConASepharose 4B親和層析后與層析介質(zhì)不結(jié)合的蛋白為非糖蛋白，將收集到的非糖蛋白經(jīng)DEAE交換層析，對(duì)每個(gè)波峰進(jìn)行再次層析、Western blot鑒定后確定最終分離的蛋白即為HSP70多肽復(fù)合物。見圖1。

圖1 分離純化樣品后蛋白的SDS-PAGE電泳圖

2.2 不同濃度HSP70多肽復(fù)合物作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見表1。

表1 不同濃度HSP70多肽復(fù)合物作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(n=6)

3 討論

熱休克蛋白(HSPs)又稱熱應(yīng)激蛋白，是生物體內(nèi)普遍存在、進(jìn)化上高度保守的一類蛋白。HSPs可以充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路，保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激刺激或其他病理生理刺激所致的死亡威脅。哺乳類動(dòng)物HSPs按其相對(duì)分子質(zhì)量可以分為 HSP90、HSP70、HSP60 和小分子 HSPs等［4］。

在非應(yīng)激狀態(tài)下，生物體內(nèi)的HSP70不表達(dá)或低表達(dá)，但是一旦遭受諸如高溫、氧化應(yīng)激和抗癌藥物等多種急性或慢性的物理性或化學(xué)性應(yīng)激因素的刺激均可導(dǎo)致其過表達(dá)以保護(hù)細(xì)胞免于各種致死性應(yīng)激因素所造成的損害。HSP70在細(xì)胞內(nèi)不僅作為分子伴侶發(fā)揮作用，還扮演著管家分子的重要角色。正常情況下，各種細(xì)胞應(yīng)激均可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，但是腫瘤組織中高表達(dá)的HSP70卻擔(dān)負(fù)著抗凋亡蛋白的作用，這種作用可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。HSP70的抗凋亡作用可能是通過抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)的，如HSP70能抑制細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激酶JNK的激活［5-6］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSP70可促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞增殖，在濃度一定時(shí)，隨著HSP70復(fù)合物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種增殖效應(yīng)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。這就說明，在一定濃度條件下HSP70對(duì)A549細(xì)胞可能具有保護(hù)作用，并能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。作者還發(fā)現(xiàn)在相同的作用時(shí)間里，復(fù)合物濃度的增加對(duì)細(xì)胞活性也有積極的影響。造成這種現(xiàn)象的原因很可能是腫瘤的形成和發(fā)展過程是以惡變細(xì)胞的惡性增殖為特點(diǎn)的，在這一異常的增殖過程中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)環(huán)境失衡，合成代謝能力增強(qiáng)，抑制代謝的能力受到抑制，整個(gè)過程需要大量的HSP70來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程。Jaattela等［7］發(fā)現(xiàn)在嚙齒類動(dòng)物模型中HSP70可以增加癌細(xì)胞的致瘤性，同時(shí)HSP70的下調(diào)可致癌細(xì)胞死亡。大量研究［8-9］證實(shí)HSP70在調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要的作用。這些都說明了HSP70在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。HSP70復(fù)合物對(duì)A549細(xì)胞的增殖作用是通過各種因素共同實(shí)現(xiàn)的，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究探討。

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