趙永福，楊紅星，唐 哲，盧賓賓

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科鄭州450052

X染色體連鎖凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)相關(guān)因子1(XIAP-associated factor-1，XAF1)是一個新發(fā)現(xiàn)的可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，其在所有胚胎組織及成人正常組織中廣泛表達，但在許多腫瘤組織和腫瘤細胞株中低表達甚至不表達，是一種潛在的腫瘤抑制因子［1-2］。XAF1位點的雜合性缺失及XAF1啟動子區(qū)的CpG島甲基化可能是其表達被抑制的機制［3-4］。作者采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific PCR，MSP)及免疫組化SP法觀察胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及XAF1蛋白的表達，探討XAF1在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月至2011年1月手術(shù)切除的胰腺癌、胰腺良性疾病和正常胰腺標本，標本均經(jīng)病理學(xué)證實。胰腺癌組48例，患者中男36例，女12例，年齡37～75歲，≤55歲13例，＞55歲35例;腫瘤位于胰頭35例，位于胰腺體尾部13例;腫瘤直徑＜3 cm 33例，≥3 cm 15例;組織學(xué)類型為高分化13例，中分化27例，低分化8例;按照2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標準，Ⅰ期6例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期7例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。胰腺良性疾病組26例，患者中男9例，女17例;胰島素瘤20例，慢性胰腺炎6例。正常胰腺組15例，患者中男9例，女6例，其中外傷切除胰腺6例，十二指腸腫物切除獲得的正常胰腺9例。所有患者術(shù)前均未給予放化療。

1.2 胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化檢測采用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA。采用EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒(ZYMO公司)，按照說明書操作，對DNA進行亞硫酸鹽修飾。采用GENMED公司MSP試劑盒進行擴增。引物參考文獻［5］，甲 基 化 上 游 引 物 序 列 5’-TTTGTA AGAAACGAAATTTAATCGA-3’，位置 －45～ －21;下游引物序列 5’-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3’，位置+182～+161;擴增產(chǎn)物大小228 bp。未甲基化上游引物序列5’-TTTGTAAGAAATGAAATT TAATTGA-3’，位置 －45～ －21;下游引物序列 5’-CTCCTACCCTTAAAACCCACAAT-3’，位置 +182 ～+161;擴增產(chǎn)物大小230 bp。MSP反應(yīng)體系為25 μL。甲基化循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性9 min;95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，35 個循環(huán);72℃終延伸5 min。未甲基化循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性9 min;94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。取產(chǎn)物5 μL，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。

1.3 胰腺組織中XAF1蛋白檢測

1.3.1 主要步驟 標本4 μm厚連續(xù)切片，按免疫組化SP法進行染色。切片脫蠟至水，pH 6.8枸櫞酸鈉緩沖液微波加熱10 min進行抗原修復(fù)。PBS沖洗，加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，非免疫動物血清37℃封閉30 min。加一抗4℃孵育過夜(XAF1一抗按250倍稀釋)。PBS沖洗，加二抗、三抗孵育，PBS洗3次，每次5 min。滴加現(xiàn)配的 DAB顯色5 min，PBS終止，蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，顯微鏡下觀察。陽性對照為試劑盒內(nèi)提供的陽性玻片，以PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人XAF1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 結(jié)果判斷 XAF1蛋白陽性細胞主要表現(xiàn)為胞核和胞質(zhì)棕黃色顆?；驁F塊狀著色，亦可表達于核膜。每例觀察5個高倍視野，根據(jù)腫瘤細胞染色程度及陽性細胞百分率進行評分。按陽性細胞百分率計分:無陽性細胞著色為0分，陽性細胞百分率＜20%為1分，20% ～75%為2分，＞75%為3分;按染色強度計分:無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。兩項積分的乘積為總分，總分達0～3分為陰性，4～9分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0進行分析，3組組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化率及XAF1蛋白陽性表達率的比較采用Fisher精確概率法或χ2檢驗，不同臨床特征胰腺癌患者2指標的比較采用χ2檢驗，采用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析胰腺癌組織中2指標表達的關(guān)聯(lián)性，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果 分別用甲基化引物和未甲基化引物擴增經(jīng)修飾的(甲基化陽性對照)和未修飾(甲基化陰性對照)的健康人外周血DNA，只有M引物和U引物得到預(yù)期大小的擴增片段，提示實驗技術(shù)、引物正確，實驗結(jié)果可靠。胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果見圖1、表 1。

圖1 胰腺癌和正常胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果

2.2 3組胰腺組織中XAF1蛋白的表達 見圖2和表1。

圖2 胰腺癌(A)、良性疾病(B)和正常(C)組織中XAF1蛋白的表達(SP，×200)

2.3 胰腺癌組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 XAF1基因啟動子區(qū)甲基化及其蛋白的表達與胰腺癌臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置無關(guān)，見表2。

2.4 胰腺癌組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化及蛋白表達的相關(guān)性 見表3，可以看出，胰腺癌組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化率與XAF1蛋白陽性表達率呈負關(guān)聯(lián)(rP= －0.463，P ＜0.001)。

表1 3組胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及XAF1蛋白的表達 例(%)

表2 胰腺癌中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化及蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

表3 胰腺癌組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化和XAF1蛋白表達的關(guān)聯(lián)性

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機制，被認為是繼突變、等位基因丟失后致抑癌基因失活的第二次打擊［6］。抑癌基因由于5’端啟動子區(qū)域CpG島異常高甲基化從而抑制了mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，導(dǎo)致該基因的沉默。抑癌基因的功能失活引發(fā)的下游事件導(dǎo)致了正常細胞的生長分化調(diào)控失常，與多種腫瘤的形成密切相關(guān)。

XAF1基因位于人類染色體17p13.2位點，有8個外顯子，由301個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為33 100，含有7個鋅指結(jié)構(gòu)。XAF1蛋白定位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)，與XIAP相互作用后，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，成為核內(nèi)包涵體。XAF1蛋白可拮抗XIAP對細胞凋亡蛋白酶(caspase)的抑制作用，通過調(diào)控G2/M檢查點，使G2/M細胞周期停滯，從而抑制腫瘤細胞生長［4］。XAF1 mRNA已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細胞株及腫瘤組織中低表達，如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎透明細胞癌、前列腺癌和小細胞肺癌等［6-9］。有研究［3，6-9］表明，在腫瘤細胞和組織中，XAF1 基因存在啟動子區(qū)異常高甲基化，甲基化程度與XAF1 mRNA表達水平呈負相關(guān)，并且與腫瘤的分期、分級有關(guān)。

在該研究中作者用MSP法檢測胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示胰腺癌組織中XAF1基因啟動子區(qū)甲基化率達31.3%，明顯高于胰腺良性疾病組織及正常胰腺組織。同時作者用SP法檢測XAF1蛋白表達，結(jié)果顯示，胰腺癌組織中XAF1蛋白陽性表達率明顯低于良性疾病組織和正常胰腺組織。進一步的分析結(jié)果顯示，XAF1基因啟動子區(qū)甲基化及XAF1蛋白的表達與胰腺癌臨床分期、腫瘤組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示XAF1啟動子區(qū)高甲基化可能是導(dǎo)致該蛋白不表達的重要機制之一，最終參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

因此，聯(lián)合檢測這兩個因子可能對胰腺癌的輔助診斷及惡性程度評價有一定意義。通過對這兩個因子在腫瘤細胞凋亡調(diào)控機制方面的進一步研究，有望尋找到一個有助于胰腺癌的早期診斷、惡性程度和預(yù)后判斷的新指標。由于XAF1具有拮抗XIAP凋亡抑制作用和控制腫瘤生長的特性，恢復(fù)XAF1的表達和功能，以降低XIAP的表達，有可能成為胰腺癌藥物治療的一個新思路。

［1］Li T，Chen CL，Wang JD，et al.Expression of heat-shock transcription factor 1 and X-linked inhibitor of apoptosis protein-associated factor-1 in gastrointestinal cancer［J］.Nan Fang Yi ke Da Xue Xue Bao，2008，28(3):487

［2］Arora V，Cheung HH，Plenchette S，et al.Degradation of survivin by the X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)XAF1 complex［J］.J Biol Chem，2007，282(36):26202

［3］Xing Z，Zhou Z，Yu R，et al.XAF1 expression and regulatory effects of somatostatin on XAF1 in prostate cancer cells［J］.J Exp Cin Cancer Res，2010，29:162

［4］Wang J，Gu Q，Li M，et al.Identification of XAF1 as a novel cell cycle regulator through modulating G2/M checkpoint and interaction with checkpoint kinase 1 in gastrointestinal cancer［J］.Carcinogenesis，2009，30(9):1507

［5］Zou B，Chim CS，Zeng H，et al.Correlation between the single-site CpG methylation and expression silencing of the XAF1 gene in human gastric and colon cancers［J］.Gastroenterology，2006，131(6):1835

［6］Byun DS，Cho K，Ryu BK，et al.Hypermethylation of XIAP-associated factor 1，a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus，in human gastric adenocarcinomas［J］.Cancer Res，2003，63(21):7068

［7］姚寶珍，劉艷紅，王則勝，等.凋亡抑制因子X-相關(guān)細胞凋亡抑制蛋白基因在肝細胞癌中的表達及臨床意義［J］.中華實驗外科雜志，2007，24(5):624

［8］馬天樂，金承榮，劉曉天，等.XAF1基因與p53基因在結(jié)直腸腫瘤中的表達研究［J］.中華消化雜志，2005，25(6):351

［9］Hervouet E，Vallette FM，Cartron PF，et al.Impact of the DNA methyltransferases expression status of apoptosis-associated genes in glioblastoma multiforme［J］.Cell Death Dis，2010，1:1