王貝貝，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

巨噬細(xì)胞(macrophage)是由血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入組織器官分化而成。作為機(jī)體天然免疫的重要細(xì)胞，巨噬細(xì)胞對(duì)感染可發(fā)生迅速反應(yīng)，既能直接吞噬、殺傷病原體而發(fā)揮非特異性免疫應(yīng)答作用，又能參與抗原的攝取、加工、處理并呈遞給T輔助細(xì)胞(T helper，Th細(xì)胞)，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答，從而將天然免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來(lái)，在抗感染免疫中具有非常重要的作用。機(jī)體感染后，一方面沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌，被巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷；另一方面，以巨噬細(xì)胞作為庇護(hù)場(chǎng)所，抵抗藥物、抗體及機(jī)體非特異性免疫分子如補(bǔ)體、溶菌酶和防御素等的殺傷。

1 巨噬細(xì)胞活化對(duì)沙門菌的清除

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，處于靜息或非活化狀態(tài)時(shí)并無(wú)殺傷作用。在組織微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的激活受多種因素影響，如入侵病原體的菌體成分及其產(chǎn)物、細(xì)胞因子、植物血凝素、寄生蟲等的刺激，都會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化并作出迅速應(yīng)答[1]?；罨蟮木奘杉?xì)胞分化為2個(gè)不同亞群：M1和M2。M1即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，CAM)，主要通過(guò)干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化，具有吞噬殺菌、釋放炎癥介質(zhì)、呈遞抗原和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能，是機(jī)體抵御外來(lái)物質(zhì)的重要防線。M2即替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，AAM)。由于活化的誘導(dǎo)物質(zhì)不同，細(xì)胞表面亦出現(xiàn)不同的活化標(biāo)記而再分為3個(gè)亞群：M2a，由白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)或IL-13誘導(dǎo)，具有抗炎作用；M2b，由免疫復(fù)合物和部分Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)或白細(xì)胞介素1受體(interleukin 1 receptor，IL-1R)的激動(dòng)劑誘導(dǎo)，具有抗原呈遞作用；M2c，由IL-10和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用和組織修復(fù)能力，但殺滅微生物的功能很弱。

Chakravortty等證明，沙門菌致病島2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI2)可阻止亞硝酸鹽在未活化巨噬細(xì)胞的含沙門菌囊泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)中積累，從而使細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中存活[2]。SPI2在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)依賴反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP。當(dāng)巨噬細(xì)胞被IFN-γ激活后，PhoP及組氨酸蛋白激酶PhoQ (PhoP-PhoQ)的活性可被高濃度的活性氮中間產(chǎn)物(reactive nitrogen intermediate，RNI)抑制，導(dǎo)致SPI2表達(dá)受抑，促進(jìn)SCV成熟，并與溶酶體融合后殺傷入侵細(xì)菌[3]。

巨噬細(xì)胞對(duì)控制和清除宿主細(xì)胞中的沙門菌非常重要。當(dāng)病原體入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞自身及其產(chǎn)物所共有的某些高度保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，被巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別，進(jìn)而將其攝入胞內(nèi)形成吞噬小體(phagosome)。后者進(jìn)一步與胞內(nèi)溶酶體融合，形成吞噬溶酶體(phagolysosome)后通過(guò)氧依賴性和非氧依賴性途徑等方式消化和清除病原體。此外，細(xì)胞因子也發(fā)揮極其重要的作用。沙門菌及其產(chǎn)物能增加巨噬細(xì)胞中mRNA表達(dá)，使其分泌多種細(xì)胞因子，如炎癥細(xì)胞因子IL-1，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，IL-6、趨化因子如炎性蛋白1α(inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β、MIP-2α，以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。

在氧依賴性途徑中，活性氧中間產(chǎn)物(reactive oxygen intermediate，ROI)和RNI是2個(gè)主要的效應(yīng)分子。ROI由吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶產(chǎn)生，RNI由NOS2基因編碼的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生。ROI可介導(dǎo)病原體快速清除，且與巨噬細(xì)胞早期殺傷沙門菌有關(guān)。在沙門菌感染早期，主要是依賴NADPH氧化酶在吞噬小體中的定位控制其生長(zhǎng)。當(dāng)TNF-α與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)p55結(jié)合活化受體后，ROI對(duì)胞內(nèi)菌的殺傷能力增強(qiáng)。在沙門菌感染后期，NOS2依賴性的RNI產(chǎn)物在限制細(xì)菌生長(zhǎng)中起重要作用。NOS2受IFN-γ、IL-12和IL-18等細(xì)胞因子的刺激，表達(dá)量顯著增加[4]。IL-12是由p35和p40兩個(gè)亞基組成的異源二聚體。沙門菌感染可導(dǎo)致IL-12 p40在派爾伊結(jié)(Peyer)、腸系膜淋巴結(jié)、脾和肝中的表達(dá)量顯著上升，而IL-12 p35的表達(dá)不受影響[5]。IL-12的另一個(gè)重要作用是誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK細(xì)胞)和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，激活巨噬細(xì)胞呈遞抗原和殺菌的能力。IFN-γ可調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)TNF-α和IL-12釋放，形成級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)。IL-18是Th1型細(xì)胞因子，在宿主抵御沙門菌感染中發(fā)揮重要作用。用抗體中和IL-18可導(dǎo)致動(dòng)物脾和肝中細(xì)菌數(shù)量增加，宿主存活率降低。用IL-18干預(yù)后，脾和肝中細(xì)菌數(shù)量降低，宿主存活率上升[6]。與IL-12一樣，IL-18可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，通過(guò)激發(fā)IFN-γ分泌促進(jìn)Th1型細(xì)胞增殖，進(jìn)一步誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-8等細(xì)胞因子產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抗感染的能力。此外，鼠傷寒沙門菌可刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-10，不僅可抑制細(xì)胞的殺菌作用，還可為該菌在細(xì)胞中增殖提供良好的宿主環(huán)境[7]。

目前，越來(lái)越多的研究報(bào)道沙門菌可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)性感染。例如，當(dāng)巨噬細(xì)胞感染了表達(dá)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，TTSS)的沙門菌，會(huì)因被誘導(dǎo)凋亡而無(wú)法將其加工處理的抗原呈遞給T細(xì)胞，但凋亡的巨噬細(xì)胞可作為沙門菌抗原的貯存庫(kù)。旁觀樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)通過(guò)攝取巨噬細(xì)胞凋亡物質(zhì)和菌體成分，以主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子的形式呈遞給T細(xì)胞。有趣的是，充當(dāng)旁觀抗原呈遞細(xì)胞似乎是DC的一個(gè)獨(dú)特功能，巨噬細(xì)胞只能攝取沙門菌誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞，而不能呈遞沙門菌抗原多肽[8]。而Guiney等認(rèn)為，沙門菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡是一種特殊的毒力機(jī)制，可促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞間傳播[9]。凋亡的發(fā)生改變了細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，從而使受體介導(dǎo)的周圍巨噬細(xì)胞啟動(dòng)對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取，導(dǎo)致細(xì)菌在巨噬細(xì)胞間不斷擴(kuò)散和感染。但適度誘導(dǎo)自噬可降低巨噬細(xì)胞凋亡率。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)劑西羅莫司〔雷帕霉素(rapamycin，RAPA)〕干預(yù)鼠傷寒沙門菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞自噬程度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)及其所致的巨噬細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示調(diào)控細(xì)胞的自噬水平可降低宿主凋亡率，有利于增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[10]。此外，天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific protease 1, caspase-1)的活化也可抑制沙門菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，它可啟動(dòng)細(xì)胞pyroptotic樣死亡，分泌促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18, 通過(guò)招募和激活免疫細(xì)胞有效清除胞內(nèi)病原菌[11]。Pyroptotic是一種促進(jìn)炎癥的細(xì)胞死亡程序，可應(yīng)對(duì)多種威脅，包括代謝應(yīng)激和細(xì)菌感染等，具有快速損壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞溶解并釋放促炎物質(zhì)的特點(diǎn)。

2 巨噬細(xì)胞作為沙門菌感染的宿主

沙門菌是一種兼性胞內(nèi)菌，侵入機(jī)體后主要寄居在單核-巨噬細(xì)胞中。沙門菌有毒株能侵襲小腸黏膜，經(jīng)回腸黏膜上M細(xì)胞(microfold cell)進(jìn)入機(jī)體。其步驟是細(xì)菌黏附、細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重排和內(nèi)在化、細(xì)菌在吞噬泡內(nèi)繁殖釋放并再次被固有層中的巨噬細(xì)胞吞噬，如此循環(huán)往復(fù)。沙門菌的黏附和入侵由染色體中的侵襲素基因inv介導(dǎo)。

沙門菌導(dǎo)致的系統(tǒng)性感染依賴于在專職吞噬性細(xì)胞中存活的能力。這個(gè)過(guò)程是復(fù)雜的，包括改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)以抵抗天然免疫的破壞，感知宿主的吞噬體環(huán)境，通過(guò)吞噬小體重塑而使宿主形成有利于細(xì)菌增殖的胞內(nèi)環(huán)境等。沙門菌對(duì)機(jī)體的毒力主要由2種TTSS介導(dǎo)，分別由SPI1和SPI2編碼，通過(guò)分泌蛋白或直接將毒力蛋白注入宿主細(xì)胞發(fā)揮致病作用。一旦細(xì)菌毒力蛋白進(jìn)入胞內(nèi)，宿主細(xì)胞功能如細(xì)胞骨架、膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子基因表達(dá)等發(fā)生改變，以利于細(xì)菌在其中生存和增殖。盡管TTSS高度保守，但這2個(gè)系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白卻是獨(dú)一無(wú)二的。2種分泌系統(tǒng)都與細(xì)菌胞內(nèi)增殖有關(guān)，SPI1編碼的TTSS在細(xì)菌侵襲的初始階段發(fā)揮重要作用，可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞前炎癥因子表達(dá)[12]、誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排啟動(dòng)大胞飲等作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌侵襲，是多種動(dòng)物和人類胃腸炎的重要致病因素[13]。SPI2編碼的TTSS及其效應(yīng)蛋白與沙門菌的系統(tǒng)感染有關(guān)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌在胞內(nèi)轉(zhuǎn)移、抑制吞噬體成熟和抵御宿主殺傷機(jī)制等方式，確保細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和生長(zhǎng)[14]。SPI2按基因結(jié)構(gòu)功能分成兩部分：一部分包含編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因(ssrA和ssrB)、編碼TTSS的結(jié)構(gòu)成分基因ssa、效應(yīng)蛋白基因sse和伴侶蛋白基因ssc；另一部分包含編碼連四硫酸鹽還原酶的基因(ttrA、ttrB、ttrC)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因(ttrR、ttrS)，與沙門菌的系統(tǒng)性感染無(wú)直接關(guān)系。研究表明，SsrB是沙門菌毒力基因的重要調(diào)節(jié)子，且SsrB能激活srfN基因，并直接控制其在細(xì)胞內(nèi)的感染[15]。SseA是SPI2依賴性轉(zhuǎn)移蛋白SifA和PipB所必需的，SifA與沙門菌在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的生存和復(fù)制密切相關(guān)。SpiC蛋白可干擾SCV在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)并阻止其與溶酶體融合，從而避開胞內(nèi)降解途徑。而spiC突變后再感染巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌致病性及生存能力大大降低[16]。

此外，沙門菌能感知宿主的胞質(zhì)pH值，SPI2編碼的TTSS pH傳感器在中性環(huán)境中構(gòu)象發(fā)生改變，引起SsaM/SpiC/SsaL調(diào)控復(fù)合物降解，從而導(dǎo)致效應(yīng)蛋白易位，而酸性環(huán)境可防止復(fù)合物降解和效應(yīng)蛋白易位[17]。不僅如此，Lee等最新研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞的酸性環(huán)境還可引發(fā)胞質(zhì)ATP水平上升，而ATP含量變化激活沙門菌毒力基因，促進(jìn)毒力蛋白表達(dá)，從而使沙門菌在宿主中得以存活[18]。

除致病島外，沙門菌的其他毒力基因?qū)ζ湓诰奘杉?xì)胞內(nèi)的進(jìn)一步生存也很重要，如攜帶spv基因的沙門菌不僅能抵抗和逃逸宿主的免疫防御，還能通過(guò)抑制自噬、促進(jìn)凋亡而加重感染[19]。另一種調(diào)節(jié)基因tdcA突變后，會(huì)影響鞭毛和PhoP調(diào)節(jié)蛋白，使沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活數(shù)量下降[20]。脂質(zhì)A的變構(gòu)對(duì)于沙門菌在胞內(nèi)生存也至關(guān)重要。脂質(zhì)A鈍化酶LpxR可通過(guò)3′-O-脫酰作用對(duì)其進(jìn)行修飾，從而降低其毒力，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的LpxR缺陷株數(shù)量明顯低于野生株。此外, 當(dāng)感染LpxR缺陷菌株時(shí)，它還可增強(qiáng)胞內(nèi)iNOS表達(dá)水平，說(shuō)明脂質(zhì)A的3′-O-脫酰作用促進(jìn)沙門菌在胞內(nèi)生長(zhǎng)[21]。

3 結(jié)語(yǔ)

沙門菌作為一種兼性胞內(nèi)菌，在宿主體內(nèi)主要寄居在單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)。在與宿主細(xì)胞長(zhǎng)期相互作用的過(guò)程中，沙門菌已進(jìn)化出一套精密的調(diào)控系統(tǒng)，不但具備抵抗溶酶體酶、抑制吞噬體-溶酶體融合、干擾ROI等逃避巨噬細(xì)胞殺傷的防御機(jī)制，而且可以巨噬細(xì)胞作為感染過(guò)程中的宿主，在細(xì)胞內(nèi)形成SCV。這不僅有利于細(xì)菌存活，還可有效逃避宿主的免疫應(yīng)答。因此，更深入了解巨噬細(xì)胞在沙門菌感染過(guò)程中的作用，將有助于探索沙門菌所致疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，同時(shí)為預(yù)防和治療提供新的思路和對(duì)策。

[1] 吳媛媛，李龍，沈萍萍.巨噬細(xì)胞替代激活及調(diào)控[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(2)：197-203.

[2] Chakravortty D, Hansen-Wester I, Hensel M. Salmonella pathogenicity island 2 mediates protection of intracellular Salmonella from reactive nitrogen intermediates [J]. J Exp Med, 2002, 195(9): 1155-1166.

[3] Bourret TJ, Song M, Vázquez-Torres A. Codependent and independent effects of nitric oxide-mediated suppression of PhoPQ and Salmonella pathogenicity island 2 on intracellular Salmonella enterica serovar typhimurium survival [J]. Infect Immun, 2009, 77(11): 5107-5115.

[4] Mastroeni P, Sheppard M. Salmonella infections in the mouse model：host resistance factors and in vivo dynamics of bacterial spread and distribution in the tissues [J]. Microbes Infect, 2004, 6(4): 398-405.

[5] Eckmann L, Fierer J, Kagnoff MF. Genetically resistant (Ityr) and susceptible (Itys) congenic mouse strains show similar cytokine responses following infection with Salmonella dublin [J]. J Immunol, 1996, 156 (8): 2894-2900.

[6] Mastroeni P, Clare S, Khan S, Harrison JA, Hormaeche CE, Okamura H, Kurimoto M, Dougan G. Interleukin 18 contributes to host resistance and gamma interferon production in mice infected with virulent Salmonella typhimurium [J]. Infect Immun, 1999, 67(2): 478-483.

[7] Lee KS, Jeong ES, Heo SH, Seo JH, Jeong DG, Choi YK. IL-10 suppresses bactericidal response of macrophages against Salmonella typhimurium [J]. J Microbiol, 2011, 49(6): 1050-1053.

[8] Wick MJ. The role of dendritic cells in the immune response to Salmonella [J]. Immunol Lett, 2003, 85(2): 99-102.

[9] Guiney DG, Lesnick M. Targeting of the actin cytoskeleton during infection by Salmonella strains [J]. Clin Immunol, 2005, 114(3): 248-255.

[10] 吳淑燕，李瓊，儲(chǔ)元元，李嫄淵，黃瑞，秦正紅.自噬對(duì)鼠傷寒沙門菌所致巨噬細(xì)胞凋亡的影響[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2010，37(5)：776-782.

[11] Puri AW, Broz P, Shen A, Monack DM, Bogyo M. Caspase-1 activity is required to bypass macrophage apoptosis upon Salmonella infection [J]. Nat Chem Biol, 2012, 8(9): 745-747.

[12] Pavlova B, Volf J, Ondrackova P, Matiasovic J, Stepanova H, Crhanova M, Karasova D, Faldyna M, Rychlik I. SPI-1-encoded type III secretion system of Salmonella enterica is required for the suppression of porcine alveolar macrophage cytokine expression [J]. Vet Res, 2011, 42(1): 16.

[13] Grassl GA, Valdez Y, Bergstrom KS, Vallance BA, Finlay BB. Chronic enteric Salmonella infection in mice leads to severe and persistent intestinal fibrosis [J]. Gastroenterology, 2008, 134(3): 768-780.

[14] Osborne SE, Coombes BK. Transcriptional priming of Salmonella pathogenicity island-2 precedes cellular invasion [J]. PLoS One, 2011, 6(6): e21648.

[15] Osborne SE, Walthers D, Tomljenovic AM, Mulder DT, Silphaduang U, Duong N, Lowden MJ, Wickham ME, Waller RF, Kenney LJ, Coombes BK. Pathogenic adaptation of intracellular bacteria by rewiring a cis-regulatory input function [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(10): 3982-3987.

[16] Lee AH, Zareei MP, Daefler S. Identification of a NIPSNAP homologue as host cell target for Salmonella virulence protein SpiC [J]. Cell Microbiol, 2002, 4(11): 739-750.

[17] Yu XJ, McGourty K, Liu M, Unsworth KE, Holden DW. pH sensing by intracellular Salmonella induces effector translocation [J]. Science, 2010, 328(5981): 1040-1043.

[18] Lee EJ, Groisman EA. Control of a Salmonella virulence locus by an ATP-sensing leader messenger RNA [J]. Nature, 2012, 486(7402): 271-275.

[19] Li YY, Wu SY, Chu YY, Liao L, Li Q, Huang R. The influence of autophagy on mouse inflammatory responses caused by Salmonella enterica serovar Typhimurium with spv genes [J]. 微生物與感染, 2011, 6(4): 205-213.

[20] Lim S, Kim M, Choi J, Ryu S. A mutation in tdcA attenuates the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium [J]. Mol Cells, 2010, 29(5): 509-517.

[21] Kawano M, Manabe T, Kawasaki K. Salmonella enterica serovar Typhimurium lipopolysaccharide deacylation enhances its intracellular growth within macrophages [J]. FEBS Lett, 2010, 584(1): 207-212.