陳春瑩 李 麗 劉小樂 陳曼詩 黃海玉

廣東省深圳市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518033

胎膜早破(premat ure rupture of membrane, PROM)是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥之一，近年來其發(fā)病率有上升趨勢，其發(fā)生機制仍不十分清楚，認為感染等多種因素導(dǎo)致胎膜細胞外基質(zhì)的降解增多，從而胎膜發(fā)生破裂，胎膜破裂后，致病菌沿生殖道上行進入羊膜腔，使感染的機會增多，但當(dāng)胎膜早破并發(fā)絨毛膜羊膜炎時大多無臨床癥狀，表現(xiàn)為亞臨床感染，威脅母兒安全。本研究采用免疫組化方法檢測Ets-1和MMP-9在胎膜中的表達，了解其在胎膜早破發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年1月至2010年10月的胎膜早破(PROM)患者50例,年齡(28.1±3.4)歲,孕次1.33±0.66；足月無產(chǎn)兆擇期剖宮產(chǎn)患者45 例(其手術(shù)指征分別為:臀位10例；巨大兒5例；高齡初產(chǎn)5例；社會因素25例),年齡(28.5±4.1)歲,孕次1.47±0.75,作為對照組。兩組均為初產(chǎn)婦,單胎,無內(nèi)外科合并癥及病理性產(chǎn)科并發(fā)癥,近期無外傷和性交等明顯誘因,兩組患者年齡及孕次均符合正態(tài)分布,且二者比較差異無顯著性(P>0.05)。所有病例經(jīng)病理檢測又分為絨毛膜羊膜炎組和非絨毛膜羊膜炎組。

1.2 絨毛膜羊膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn) 孕婦體溫≥38℃或連續(xù)2次間隔1h以上體溫>37.5℃而排除其他感染存在及至少有下列4項中的1 項:(1)孕婦心率≥100次/min或原因不明的胎心率≥160次/mim；(2)子宮有壓痛；(3)白細胞計數(shù)>15×109L-1；(4)排出物有臭味或呈膿性。如果孕婦體溫正常,則必須同時具備上述四項,診斷方成立。僅出現(xiàn)實驗室指標(biāo)異常,則診斷為亞臨床型絨毛膜羊膜炎[1]。絨毛膜羊膜炎的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]:在絨毛膜及羊膜組織中,中性粒細胞浸潤每高倍視野5～10個為輕度；11～30個為中度；大于30個為重度。

1.3 胎膜標(biāo)本采集及處理 所有產(chǎn)婦在胎盤胎膜娩出后立即剪取距胎膜破口處>2cm的全層胎膜組織，2cm×2cm大小，生理鹽水沖凈血跡和羊水，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包理，均作4μ m厚連續(xù)切片2張，一張行HE染色診斷行病理檢查，了解是否存在絨毛膜羊膜炎，采用雙盲法由專人看片。另一張采用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定Ets-1和MMP-9表達水平。

1.4 主要試劑 Ets1 鼠抗人多克隆抗體(克隆號sc2350)為Santa－Cruz公司產(chǎn)品, 兔抗人MMP-9多克隆抗體、通用型S-P免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.5 方法 采用免疫組化中敏感性高的親和組織化學(xué)技術(shù)：酶標(biāo)鏈親和素－生物素技術(shù)（S-P）法。以PBS代替第一抗體作為陰性對照，以胎膜各層部分細胞胞漿和（或）胞核出現(xiàn)棕色顆粒狀物質(zhì)視為陽性染色。

1.6 結(jié)果判定 以染色強度與陽性染色細胞百分率的乘積作為半定量標(biāo)準(zhǔn)。高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野,每個視野記數(shù)100個細胞。①染色強度計分: 0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為黃褐色；②按陽性染色細胞百分率計分。0分為陰性,1分為陽性細胞0%～25%,2分為25%～50%，3 分為51%～75%,4分為>75%。最后將陽性率評分與強度評分相乘所得之積計為該組織的免疫組化最終評分。綜合評分為1～2分者為弱陽“+”,3～4分者為陽性“+ +”,5～7分者為強陽性“+ + +”。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 絨毛膜羊膜炎的病理學(xué)診斷情況 見表1 ,研究組臨床未診斷出絨毛膜羊膜炎,診斷亞臨床型絨毛膜羊膜炎34例(34/50),后經(jīng)病理學(xué)證實均為絨毛膜羊膜炎共34例,其中輕度有5例(5/50),中度有10 例(10/50),重度有19例(19/50)。對照組胎膜病理學(xué)檢測出絨毛膜羊膜炎共10例,其中輕度4例(4/ 45),中度4例(4/45),重度有2例(2/45)。

2.2 Ets-1和MMP-9在各組中的表達 見表2,對所收集的組織樣本進行免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)Ets-1和MMP-9在各組中均有不同程度的表達,如表2所示,但研究組的表達明顯高于對照組,兩者間差異有顯著意義(P< 0.05),在病理學(xué)診斷絨毛膜羊膜炎的病例中炎癥越重的病例Ets-1和MMP-9的表達越明顯。

3 討 論

胎膜破裂發(fā)生于產(chǎn)程正式開始前稱為胎膜早破(premat ure rupture of membrane, PROM),胎膜早破是產(chǎn)科常見的并發(fā)癥之一,日益受到關(guān)注,其發(fā)生機制的研究仍不十分清楚,在所有發(fā)生胎膜早破的因素中,感染是其最重要的原因,且與胎膜早破互為因果。胎膜早破的發(fā)生并不等于感染的發(fā)生,但提示機體有發(fā)生感染的極大可能性,胎膜早破持續(xù)時間越久,母嬰接觸病原體機會越多,感染機率越大。羊膜腔感染的征象常出現(xiàn)在感染的晚期,組織學(xué)上有絨毛膜羊膜炎證據(jù)的患者中僅有25%出現(xiàn)臨床征象[3]。本研究觀察除34 例患者表現(xiàn)亞臨床絨毛膜羊膜炎外均未出現(xiàn)臨床感染,但其病理提示有68%存在絨毛膜羊膜炎的組織學(xué)證據(jù),故胎膜早破仍是羊膜腔感染的重要因素。

Ets-1是Ets轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中最基本的成員之一[4],是分子量為54ku的核內(nèi)蛋白,同時又是編碼降解和重塑細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)的蛋白酶(諸如MMP1、MMP3、MMP9等)等許多基因的必需轉(zhuǎn)錄因子。MMP-9是明膠酶中的一種，除有MMPs的原型結(jié)構(gòu)外，MMP-9的催化區(qū)還包括3個重復(fù)的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。目前, 已證實MMPs啟動子區(qū)域的PEA23位點可與Ets-1結(jié)合,是一個功能轉(zhuǎn)錄元件[5],而MMP9 基因啟動子序列上有4個Ets-1結(jié)合元件,故Ets-1可上調(diào)MMP9的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在胎膜早破 病例中,與正常對照組相比,其胎膜的Ets-1和MMP-9 蛋白的表達量明顯增加.

表1 兩組病理檢查結(jié)果

表2 Ets-1和MMP-9 在各組中的表達

本實驗結(jié)果顯示,胎膜早破組絨毛膜羊膜炎的發(fā)生率為68%,而對照組為22.22%,兩組比較差異有顯著意義(P<0.01),說明胎膜早破與感染互為因果[6]。在各組胎膜中均能檢測到Ets-1和MMP-9的存在,但在胎膜早破中表達水平增高,而且在胎膜早破合并感染時, Ets-1和MMP-9在胎膜組織中的表達水平更明顯增加,表達程度與感染程度相關(guān),感染越重表達越明顯,其表達量高于胎膜早破非感染組和足月組。在胎膜早破患者中,發(fā)現(xiàn)其滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)排列紊亂,膠原斷裂及部分滋養(yǎng)細胞凋亡,這種形態(tài)學(xué)改變可能與維持胎膜緊張度的ECM降解加速有關(guān)。在胎膜中ECM 降解的調(diào)節(jié)和動態(tài)變化是由MMPs所控制,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多MMPs(包括MMP1,MMP2,MMP9)在胎膜早破的羊水和胎膜中被上調(diào),且MMPs在基因轉(zhuǎn)錄、活化水平上被調(diào)節(jié)。在這些基因中和轉(zhuǎn)錄因子Ets-1有關(guān)的是編碼某些蛋白酶的基因,諸如MMP1、MMP2、MMP3和MMP9[7]由此我們可以看出,胎膜滋養(yǎng)層中Ets-1蛋白表達量增加可引起MMPs基因產(chǎn)物的增加,這就導(dǎo)致此區(qū)域ECM的降解加速,打破了能維持胎膜張力的細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡。ECM的降解導(dǎo)致胎膜結(jié)構(gòu)的減弱和破裂從而引起胎膜早破。基因轉(zhuǎn)錄增加的重要原因之一是轉(zhuǎn)錄因子蛋白增加或轉(zhuǎn)錄活性增加。這進一步說明,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Ets-1蛋白在胎膜早破絨毛膜滋養(yǎng)層中高表達,其通過對靶基因MMP1,MMP3,MMP9,u2PA和整合素β3等的調(diào)控,導(dǎo)致其產(chǎn)物增加,從而使ECM降解加速和重塑。

本研究表明, Ets-1和MMP-9與胎膜早破及絨毛膜羊膜炎的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,目前對Ets-1和MMP-9如何調(diào)節(jié)胎膜早破的發(fā)動尚不清楚,隨著對細胞因子生物學(xué)的逐步深入,這個秘密終會揭開,而深入了解胎膜早破的發(fā)生機制必將有助于人們發(fā)現(xiàn)治療新方法,有助于預(yù)測胎膜早破及絨毛膜羊膜炎發(fā)生,對降低母嬰并發(fā)癥和預(yù)防新生兒遠期并發(fā)癥有一定價值。

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