曾令軍 王保龍 馬筱玲 王 斌 賀學(xué)嬌 丁邦勝

安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230001

隨著血細(xì)胞分析儀在各級(jí)醫(yī)院的廣泛應(yīng)用，血小板的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)是臨床醫(yī)生和檢驗(yàn)人員共同關(guān)注的問(wèn)題，尤其是巨大血小板（Giant platelet）的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，由于受目前大多數(shù)血小板分析儀的計(jì)數(shù)原理和功能的限制，多無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。而過(guò)去認(rèn)為罕見(jiàn)或者少見(jiàn)的巨大血小板，隨著檢測(cè)手段的多樣化和血細(xì)胞分析儀的普及，在孕婦、心血管疾病、血液病等患者中常被檢出。因此，迫切需要對(duì)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)巨大血小板進(jìn)行評(píng)價(jià)。本文利用檢驗(yàn)界廣泛應(yīng)用的，性能優(yōu)良的日本Sysmex 公司的XE-2100血細(xì)胞分析儀，對(duì)經(jīng)涂片、染色、鏡檢證實(shí)，巨大血小板占血小板總數(shù)30%以上的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，探討XE-2100血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)巨大血小板的準(zhǔn)確性，為臨床選擇巨大血小板檢測(cè)方法提供客觀(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本Sysmex 公司的XE-2100血細(xì)胞分析儀；Olympus BX51顯微鏡; 重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司CMIS-2011骨髓細(xì)胞分析系統(tǒng)；牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

1.2 試劑 XE-2100配套原裝試劑、質(zhì)控物，由日本東亞公司提供。瑞氏-吉姆薩染液由BASO公司提供。靜脈采血用乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)真空抗凝管，由上海科華公司提供。血小板草酸銨稀釋液按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版的要求配制[1]。

1.3 標(biāo)本來(lái)源 6例樣本均為本院病人，均經(jīng)涂片、染色、鏡檢證實(shí)（見(jiàn)圖1-7），其血小板以巨大血小板為主，高達(dá)30%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出薛飛平[2]報(bào)告的正常人巨大血小板占0.7-2.0%的參考范圍。受檢者早晨空腹，采血由技術(shù)熟練護(hù)士在患者左上臂扎止血帶，禁止拍打采血部位，在1分鐘內(nèi)從肘正中靜脈一次順利抽血2ml置EDTAK2真空抗凝管，立即上下顛倒混勻8次，室溫放置，所有計(jì)數(shù)檢測(cè)均在采集標(biāo)本后2h內(nèi)完成。

1.4 方法 Sysmex XE-2100使用前已校準(zhǔn)，每日測(cè)定三個(gè)水平配套質(zhì)控物，結(jié)果均在靶值允許范圍內(nèi)再進(jìn)行日常標(biāo)本的檢測(cè)。分別用Sysmex XE-2100的電阻抗法(PLT-I)和光學(xué)法(PLT-O)及手工顯微鏡計(jì)數(shù)法，三種方法分別對(duì)上述6例血液中有大量巨大血小板（>30%）患者的標(biāo)本進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。電阻抗法(PLT-I)檢測(cè)采用儀器第3檢測(cè)模式(CBC+DIFF)進(jìn)行檢測(cè)；光學(xué)法(PLT-O)檢測(cè)用儀器第4檢測(cè)模式(CBC+DIFF+RET)進(jìn)行檢測(cè)；以手工顯微鏡計(jì)數(shù)法為標(biāo)準(zhǔn)，判斷Sysmex XE-2100計(jì)數(shù)血小板結(jié)果的準(zhǔn)確性。手工顯微鏡計(jì)數(shù)由兩位高年資主管檢驗(yàn)師，采用雙盲法計(jì)數(shù)，取兩人均值。每一例標(biāo)本均制作血涂片，行瑞-吉染色后油鏡觀(guān)察巨大血小板形態(tài)，經(jīng)Olympus BX51顯微鏡攝影。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)XE-2100血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)巨大血小板的準(zhǔn)確性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 三種血小板計(jì)數(shù)方法，每?jī)煞N方法之間，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)結(jié)果 6例標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)，同時(shí)采用三種方法即Sysmex XE-2100的電阻抗法(PLT-I)、光學(xué)法(PLT-O)和手工顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，其結(jié)果及血涂片中巨大血小板比例見(jiàn)表1。MPV(平均血小板體積)、PCT(血小板壓積)、PDW(血小板分布寬度)、P-LCR(大血小板百分比)等血小板參數(shù)儀器均無(wú)法測(cè)出。為減少誤差采用同一標(biāo)本配對(duì)T檢驗(yàn)[電阻抗法(PLT-I)和光學(xué)法(PLT-O)，電阻抗法(PLT-I)和手工顯微鏡計(jì)數(shù)法，光學(xué)法(PLT-O)和手工顯微鏡計(jì)數(shù)法],分析三種方法計(jì)數(shù)巨大血小板的一致性。結(jié)果，PLT-O法計(jì)數(shù)巨大血小板與手工顯微鏡計(jì)數(shù)法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PLT-I法計(jì)數(shù)巨大血小板與PLT-O法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PLTI法計(jì)數(shù)巨大血小板與手工顯微鏡計(jì)數(shù)法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 圖形結(jié)果 圖1-6顯示6例血小板直方圖均明顯異常，直方圖尾部陡然向上抬高。其中，例1和例2血小板直方圖相似，表現(xiàn)為血小板直方圖無(wú)擬合曲線(xiàn)，在2～35fl區(qū)域十分平坦，而在35fl右側(cè)急劇陡然升高，這與兩例患者均為巨大血小板綜合癥(BSS)，巨大血小板在血涂片中高達(dá)60%以上有關(guān)；例3、4、6血小板血小板直方圖相似，在2～35fl區(qū)域大致呈現(xiàn)正常的左偏態(tài)擬合曲線(xiàn)，但在35fl右側(cè)也表現(xiàn)為急劇陡然升高，這與三位患者巨大血小板在血涂片中占30-60%有關(guān)；例5的血小板直方圖有別于其它5例，是在2～20fl區(qū)域呈現(xiàn)正常的血小板直方圖左偏態(tài)擬合曲線(xiàn)，在20～35fl區(qū)域陡然升高。在> 35fl右側(cè)呈高位水平直線(xiàn)，這可能是該患者體積是紅細(xì)胞2倍以上的特大血小板占10%造成的。此外，6例標(biāo)本紅細(xì)胞直方圖均表現(xiàn)正常，巨大血小板未對(duì)紅細(xì)胞直方圖造成干擾，所有6例標(biāo)本的血涂片中均易見(jiàn)到巨大血小板。

2.3 報(bào)警結(jié)果 血小板報(bào)警提示：血小板聚集(PLT Clumps)，血小板直方圖異常(PLT abn Dst)

3 討 論

巨大血小板是指MPV≥30fl或者直徑≥1/2紅細(xì)胞的血小板[3]，具體是指血小板直徑＞7.5μm[4]，在實(shí)際血涂片觀(guān)察中通常以直徑≥1/2紅細(xì)胞來(lái)判定。巨大血小板已成為研究出血性疾病、血栓性疾病及血液病的重要內(nèi)容。

血小板體積越大其活性越強(qiáng)，血小板間的聚集和粘附能力越強(qiáng)，易于發(fā)生血小板凝集，形成血栓，出現(xiàn)急性心肌梗塞、腦梗塞或腦出血的可能性較大[5]。巨大血小板綜合癥(BSS)、血小板無(wú)力癥、灰色血小板綜合癥、骨髓異常綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜、血友病、骨髓纖維化、慢性粒細(xì)胞白血病、惡性腫瘤、孕婦及血小板的活化[6]等都會(huì)出現(xiàn)數(shù)量不等的巨大血小板。既然巨大血小板在多種疾病中廣泛存在，那么在血小板計(jì)數(shù)時(shí)，能否將巨大血小板計(jì)數(shù)在內(nèi)直接關(guān)系到血小板的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

準(zhǔn)確計(jì)數(shù)血小板實(shí)非易事[7]。采用傳統(tǒng)的電阻抗法檢測(cè)技術(shù)，單純依靠細(xì)胞體積一個(gè)檢測(cè)參數(shù)，無(wú)法有效區(qū)分其它干擾物質(zhì)，特別是無(wú)法區(qū)分病理標(biāo)本中的巨大、大血小板。Sysmex XE-2100血液分析儀可采用電阻抗法(PLT-I)以細(xì)胞體積的大小計(jì)數(shù)血小板，儀器將在2～35fl范圍內(nèi)的細(xì)胞定義為血小板，因此，當(dāng)血小板顆粒大于35f時(shí)，儀器就無(wú)法將其計(jì)數(shù)為血小板。這可以從表1和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果[PLT-I法與PLT-O法 (P<0.01)；PLT-I與手工顯微鏡計(jì)數(shù)法(P<0.05)]得到證明。

圖1 例1 紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×；圖2 例2紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×；圖3 例3 紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×；圖4 例4紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×； 圖5 例5紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×；圖6 例6紅細(xì)胞、血小板直方圖及血涂片1000×。

表1 6例患者三種血小板測(cè)定方法結(jié)果（×109/L)及血涂片中巨大血小板比例（%）

圖7 例1計(jì)數(shù)板內(nèi)以巨大血小板為主 200×。

Sysmex XE-2100血液分析儀也可采用采用半導(dǎo)體單通單光散射法和流式細(xì)胞技術(shù)[8]，(光學(xué)法，PLT-0)測(cè)定PLT。光學(xué)法則利用兩種熒光染料：聚次甲基和噁嗪，可以透過(guò)細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞內(nèi)RNA、DNA進(jìn)行染色。在光法計(jì)數(shù)通道內(nèi)，663nm波長(zhǎng)的激光照射在細(xì)胞上，產(chǎn)生前向散射光(FSC)信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞體積大?。粋?cè)向散射光(SSC)信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞核等內(nèi)含物的信息；側(cè)向熒光(SFL)強(qiáng)度信號(hào)則用于分析細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的含量[9，10]。血小板體積較紅細(xì)胞小，散點(diǎn)圖上分布在紅細(xì)胞下方，血小板內(nèi)含極少量的核酸，側(cè)向熒光的強(qiáng)度較成熟紅細(xì)胞稍大，因此能有效區(qū)分紅細(xì)胞和血小板[11]。這可以從圖1～6中紅細(xì)胞直方圖上得到證明：Sysmex XE-2100血液分析儀可以有效排除巨大血小板對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的干擾。

但從表1和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果來(lái)看，光學(xué)法（PLT-0)計(jì)數(shù)巨大血小板與手工顯微鏡計(jì)數(shù)法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明光學(xué)法（PLT-0)測(cè)定巨大血小板的準(zhǔn)確性?xún)H比電阻抗法(PLT-I)好，確不如手工顯微鏡計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確，尤其是對(duì)于例1、例2這樣的巨大血小板綜合癥(BSS)患者，在巨大血小板在血涂片中高達(dá)60%以上時(shí)，光學(xué)法（PLT-0)結(jié)果與手工顯微鏡計(jì)數(shù)法結(jié)果相差懸殊。這是由于日常臨床工作中應(yīng)用的血細(xì)胞自動(dòng)分析儀多為單光散射法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，這種計(jì)數(shù)在血細(xì)胞數(shù)目或體積極大時(shí)是不準(zhǔn)確的。BSS患者血小板中至重度減少，且血小板體積偏大，導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)偏差。這種情況可選用人工血小板計(jì)數(shù)[12]，如果能對(duì)這類(lèi)標(biāo)本制作血涂片進(jìn)行形態(tài)學(xué)復(fù)查則更佳。

在運(yùn)用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)標(biāo)本過(guò)程中，如何能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中巨大血小板對(duì)儀器的干擾呢? 儀器的血小板報(bào)警提示：血小板聚集(PLT Clumps)，血小板直方圖異常(PLT abn Dst)；直方圖的特征性改變；MPV、PCT、PDW、P-LCR等血小板參數(shù)儀器無(wú)法測(cè)出，均能提示我們標(biāo)本中存在巨大血小板對(duì)儀器的干擾。這時(shí)可采用手工顯微鏡計(jì)數(shù)法并制作血涂片進(jìn)行形態(tài)學(xué)復(fù)查，可以準(zhǔn)確確認(rèn)并計(jì)數(shù)血小板，為臨床診斷提供客觀(guān)、有價(jià)值的結(jié)果，避免誤診誤治。

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