羅銀華，劉波，朱育菁，肖榮鳳，楊瑩瑩，楊盛春

（1.福建建寧縣蓮籽科學(xué)研究所，354500；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所）

子蓮病原菌的分離與鑒定研究

羅銀華1，劉波2，朱育菁2，肖榮鳳2，楊瑩瑩2，楊盛春1

（1.福建建寧縣蓮籽科學(xué)研究所，354500；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所）

通過分離發(fā)病組織的內(nèi)生菌，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，12類樣品中第8類未分離到任何菌，樣品第5類和第11類為細(xì)菌病害，其余為真菌病害，其中第1類病原菌為黑附球菌，第2類和第3類病原菌為鐮刀菌，第4類病原菌為擬莖點(diǎn)菌，第6類、第7類、第9類、第10類和第12類病原菌均為鏈格孢菌。

子蓮；病原菌；分離；鑒定

子蓮為睡蓮科蓮屬多年生宿根草本植物，是一種高效益的水生經(jīng)濟(jì)作物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，江南各地均有廣泛的栽培。隨著各地產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，其栽培面積有不斷擴(kuò)大之勢(shì)。近年來，建寧縣子蓮種植面積穩(wěn)定在3 330 hm2，但子蓮的病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，造成減產(chǎn)甚至絕收，已成為發(fā)展子蓮生產(chǎn)的一大障礙。因此本研究對(duì)子蓮的病原菌進(jìn)行分離和鑒定，通過分離不同病癥的蓮內(nèi)生菌，并提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過比對(duì)，從而確定這些菌株的分類結(jié)果，為各種病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

①供試子蓮 子蓮品種為有典型發(fā)病癥狀的建選17號(hào)、建選35號(hào)蓮株。2011年6月取自建寧縣蓮科所育種基地和種質(zhì)資源圃。

②培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 （分離真菌）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，鏈霉素0.3 g，pH值7.0左右。

NA培養(yǎng)基（分離細(xì)菌）：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2~7.6。

③試劑 無菌水，75%酒精，10%次氯酸鈉。

④儀器 超凈工作臺(tái)，酒精燈，接種環(huán)，恒溫培養(yǎng)箱，鑷子，高壓滅菌鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

①樣品的分類 根據(jù)癥狀的不同，將樣品分為12類，其中第1至第9類為蓮葉片，第10至第12類為蓮莖稈。

②植株內(nèi)生菌的分離 自來水沖洗干凈植株根部泥土后，酒精表面消毒。將植株組織切成厚度為2~3 mm均勻片狀。將切片在75%的酒精溶液中浸泡2~3 s，后在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒7~8 min后，用無菌水漂洗3次，將植物組織片貼到PDA和NA平板表面，倒置培養(yǎng)3~4 d，觀察內(nèi)生菌的生長(zhǎng)情況。

③純化 觀察分離培養(yǎng)的菌落，將要純化的菌落標(biāo)記。用接種環(huán)在菌落邊緣挑取一點(diǎn)接種于平板中央，真菌培養(yǎng)7 d，細(xì)菌培養(yǎng)1 d后進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定。

④DNA的獲得 細(xì)菌用裂解法提取DNA，真菌菌絲按尿素提取法提取DNA。

⑤真菌的ITS的 PCR擴(kuò)增 采用特異引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，ITS4（10 pmol）1.0 μL，ITS5（10 pmol）1.0 μL，采用超純水定容至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃，5 min；循環(huán)的程序?yàn)?4℃變性 60 s，55℃復(fù)性 60 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴(kuò)增結(jié)果。

⑥細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增 采用特異引物16S1和16S2對(duì)細(xì)菌菌落16S rDNA片段的進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同。

⑦PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和比對(duì)分析 經(jīng)驗(yàn)證為目的片段的PCR純化產(chǎn)物送上海博尚生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮葉病害癥狀

不同癥狀的樣品分類如圖1，第1~12類。

2.2 內(nèi)生菌的分離

部分樣品內(nèi)生菌分離及純化照片如圖2所示，各類樣品內(nèi)生菌的分離情況如表1所示。

2.3 各菌株的ITS及16S PCR擴(kuò)增

圖3為真菌ITS擴(kuò)增結(jié)果，圖4為細(xì)菌16S擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 序列測(cè)定與分析

行序列比對(duì)得到的結(jié)果如表2所示。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)將采集的子蓮按不同的癥狀進(jìn)行分類，通過分離發(fā)病組織的內(nèi)生菌來確定病原菌。經(jīng)菌株鑒定后表明，除了第8類未分離到任何菌，樣品第5類和第11類為細(xì)菌病害，其余為真菌病害，其中第1類病原菌為黑附球菌，第2類和第3類病原菌為鐮刀菌，第4類病原菌為擬莖點(diǎn)菌，第6類、第7類、第9類、第10類和第12類病原菌均為鏈格孢菌。在此基礎(chǔ)上，已著手開展病原菌回接試驗(yàn)和藥劑篩選試驗(yàn)。

Isolation and Identification of Pathogens from Seed Lotus

LUO Yinhua1,LIU Bo2,ZHU Yujing2,XIAO Rongfeng2,YANG Yingying2,YANG Shengchun1
(1.Jianning Research Institute of Lotus Seeds,Fujian 354500;2.Agricultural Bio-resources Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences)

Endophytes were isolated from 12 types of disease-infected tissues of seed lotus,and their total DNA were extracted as PCR templates.The PCR products were sequenced and analyzed for identification.The results showed that none endophyte was obtained from the 8th type sample among the 12 type samples of seed lotus.The 5th and 11th type samples were infected by bacterial infection,and the rest were induced by fungal infection.The pathogen of the 1st type sample was identified asEpicoccum nigrum,while pathogens of the 2nd and 3rd type samples wereFusarium orobanches, the pathogen of the 4th type sample wasPhomopsis mcrosporKoby&Chib,and the pathogens of the rest samples wereAlternariaspp..

Seed lotus;Pathogens;Isolation;Identification

表1 蓮不同病癥樣品組織內(nèi)生菌分離情況

圖4 16S的PCR擴(kuò)增電泳圖譜

表2 蓮內(nèi)生菌的種類鑒定

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.036

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“水生蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究與示范”（200903017-6）

羅銀華（1967-），女，高級(jí)農(nóng)藝師，副所長(zhǎng)，主要從事子蓮品種選育及栽培技術(shù)研究推廣工作，E-mail：lyh1991@126.com

2012-06-20