梁 祥 王紅亮 黃婷婷 唐剛?cè)A 胡孔珍 吳克寧

(中山大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科 廣州 510080)

放射性標記氨基酸正電子發(fā)射斷層(PET)和單光子發(fā)射計算機斷層(SPECT)顯像劑已應用于臨床上，其與2-18F-2-脫氧-D-葡萄糖(18F-FDG)聯(lián)用，可彌補18F-FDG的某些不足，有助于鑒別腫瘤組織與炎癥或其他糖代謝旺盛病灶[1]。目前，應用的氨基酸PET顯像劑絕大多數(shù)空間構(gòu)型為L型。但是，Tamemasa等[2,3]報道了放射性標記D-氨基酸也可作為腫瘤顯像劑。研究表明，2-[123I]碘代-D-苯丙氨酸(2-123I-D-Phe)[4,5]、[11C]D-蛋氨酸(11C-D-MET)[6]、O-([11C]甲基)-D-酪氨酸(11C-D-CMT)[6]、O-([18F]氟甲基)-D-酪氨酸(18F-D-FMT)[6,7]、O-2-([18F]氟乙基)-D-酪氨酸(18F-D-FET)[7]、O-(3-[18F]氟丙基)-D-酪氨酸(18F-D-FPT)[7]腫瘤顯像優(yōu)于各自相應的L-氨基酸。因此，標記D-氨基酸可望作為腫瘤氨基酸顯像劑。本文報道(S-[11C]甲基)-D-半胱氨酸(11C-D-MCYS)的自動化合成與初步動物實驗研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氫化鋁鋰(1.0 mol/L，LiAlH4)、氫碘酸(HI)、D-半胱氨酸(D-CYS，美國Sigma-Aldrich公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；Sep Pak Plus C18柱(美國Waters公司)；GEMINIGXL-16型PET-CT掃描儀(北愛爾蘭PHILIPS公司)；安捷倫1200型分析型高效液相層析儀(美國Agilent公司)；高效液相層析放射性檢測儀(美國華盛頓Bioscan公司)；FC3200型NaI高能PMT放射性檢測器(美國華盛頓Bioscan公司)；Cyclone10/5回旋加速器(比利時IBA公司)；碳-11碘甲烷合成模塊(PET-CS-I-IT-I) (北京派特生物有限公司)；昆明種小鼠(雌性、清潔級、4-6周齡)、S180小鼠肉瘤細胞株(中山大學實驗動物中心)。

1.2 11C-D-MCYS的自動化合成

由 PET回旋加速器生產(chǎn)11CO2，通過低溫 N2捕集、釋放、干燥后進入反應管。通入的11CO2與LiAlH4發(fā)生還原反應生成11CH3OH，再與HI發(fā)生取代反應生成11CH3I。11CH3I與前體D-CYS在Sep Pak Plus C18柱上發(fā)生烷基化反應生成11C-D-MCYS，其合成路線見圖1。

由PET回旋加速器通過核反應14N(p,a)11C生產(chǎn)11CO2，然后傳送到碘甲烷合成模塊中。11CO2通過Loop環(huán)(液氮冷卻至–160oC )被捕集。移去液氮冷卻環(huán)，通入He氣(20 mL/min)并釋放11CO2，經(jīng)P2O5柱干燥后進入反應管。通入的11CO2與LiAlH4發(fā)生還原反應生成11CH3OH，再與HI發(fā)生取代反應生成11CH3I。在He氣作用下，11CH3I被傳輸?shù)絊ep Pak Plus C18柱。

實驗前，將3–4 mg 前體D-CYS溶于0.25 mL含0.5 mol/L NaOH的乙醇-水(體積比為1:1)溶液中，裝載于Sep Pak Plus C18柱中。11CH3I在Sep Pak Plus C18柱上與D-CYS發(fā)生烷基化反應生成11CD-MCYS。用5 mL NaH2PO4(0.05 mol/L、pH=3–4)緩沖液洗脫Sep Pak Plus C18柱上的11C-D-MCYS，淋洗液通過一個Sep Pak Plus C18柱和0.22 μm過濾膜進入無菌瓶中，得到11C-D-MCYS注射液。

圖1 11C-D-MCYS的合成路線Fig.1 Synthetic scheme of 11C-D-MCYS.

1.3 11C-D-MCYS的質(zhì)量檢驗

用標準pH試紙測定注射液的pH值，目測其顏色和澄清度。使用放射性HPLC，反相分析型XDBC18柱(4.6′150 mm，5 μm)和NaI高能PMT放射性檢測器測定放化純度，流動相為 VA(3 mmol/L NaH2PO4):VB(甲醇)=45:55，流速為1 mL/min，254 nm UV 檢測。

1.4 動物模型制作及PET-CT顯像

無菌條件下在小鼠右大腿肌肉注射 0.2 mL松節(jié)油，3–4天右腿出現(xiàn)肌肉膿腫者為炎癥模型；將S180小鼠肉瘤細胞株復蘇后，培養(yǎng)3–4代，制成癌細胞懸浮液，調(diào)整濃度為1×107個/mL，取0.1 mL注射到小鼠右背皮下。接種后第10天，小鼠右背部可見明顯腫塊，瘤直徑>1 cm入選為腫瘤模型。所有動物飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心實驗室動物房，恒溫恒濕條件，定時給食。

腹腔注射10%的水合氯醛0.1 mL麻醉小鼠，待其意識消失，經(jīng)尾靜脈分別注射0.2 mL(3.7 MBq)的11C-D-MCYS和18F-FDG，固定于紙板上。于注射后15、30、45、60 min行PET-CT全身顯像，經(jīng)衰減矯正后，迭代重建獲得橫斷面、矢狀面、冠狀面斷層圖像及MIP(maximum intensity projection)圖像。

2 結(jié)果和討論

2.1 11C-D-MCYS的自動化合成與質(zhì)量檢測

11CO2與LiAlH4發(fā)生還原反應后，再與HI發(fā)生取代反應生成11CH3I，未校正放化產(chǎn)率為65%–75%(n=4)，放化合成時間約7.5–9.5 min；11CH3I與前體D-CYS在Sep Pak Plus C18柱上發(fā)生烷基化反應生成11C-D-MCYS，11C-D-MCYS未校正放化產(chǎn)率為(51±4)%(n=4)，放化合成時間~2 min，總放化合成時間~12 min。11C-D-MCYS注射液為無色或淺黃色溶液(pH=6–8)，11C-D-MCYS的放化純度>99%。11C-D-MCYS HPLC圖譜示于圖2，其保留時間約1.8–2.3 min，標準品D-MCYS的保留時間約為1.5–1.9 min，11CH3I的保留時間約為5.8–6.5 min。本法制備11C-D-MCYS的步驟和工藝簡單，可用于實現(xiàn)11C-D-MCYS的自動化合成，其注射液可用于動物實驗。

圖2 11C-D-MCYS放射性色譜(a)、紫外線色譜(b)和標準品D-MCYS紫外線色譜(c)Fig.2 Typical high-performance liquid chromatograms of 11C-D-MCYS and standard coinjection: radioactive chromatogram of 11C-D-MCYS (a) and ultraviolet chromatogram of 11C-D-MCYS(b) and standard D-MCYS (c).

2.2 動物PET-CT顯像

11C-D-MCYS和18F-FDG PET-CT顯像結(jié)果示于圖 3，圖中十字線中心指示腫瘤或炎癥。小鼠尾靜脈注射11C-D-MCYS后，放射性很快分布全身，腹部和膀胱的放射性較高。大量11C-D-MCYS聚集于膀胱，因此11C-D-MCYS主要經(jīng)過泌尿系統(tǒng)排泄。炎癥組織放射性攝取較低，在15 min時攝取較高，爾后呈降低趨勢，60 min時炎癥組織與對側(cè)大腿肌肉的放射性攝取比值為 1.27±0.09(n=4)；腫瘤組織攝取11C-D-MCYS明顯高于周圍正常組織，11C-DMCYS攝取隨時間增加，60 min時腫瘤組織與對側(cè)大腿肌肉的攝取比值為 4.04±1.01(n=4)。尾靜脈注射18F-FDG后，炎癥組織和腫瘤組織攝取18F-FDG明顯高于周圍正常組織，60 min時炎癥組織和腫瘤組織與左大腿肌肉的攝取比值分別為3.13±0.32 (n=4)和 4.22±0.71(n=4)。因此，11C-D-MCYS在腫瘤顯像方面具有一定的潛力，在區(qū)分炎癥和腫瘤方面優(yōu)于18F-FDG。

圖3 腫瘤模型(上)和炎癥模型(下)小鼠11C-D-MCYS PET-CT顯像(a)和18F-FDG PET-CT顯像(b)Fig.3 PET imaging of S180 sarcoma-bearing (upper) and aseptic inflammation(low) mice models with 11C-D-MCYS (a) and 18F-FDG (b).

2.3 組織病理檢查

小鼠顯像后，解剖取左側(cè)肌肉、膿腫和腫瘤處組織進行切片檢查(圖4)。經(jīng)H&E染色后鏡下觀察，左側(cè)肌肉組織表現(xiàn)為橫紋肌纖維有序排列，為正常組織(a)；膿腫處組織表現(xiàn)為橫紋肌組織中大量的炎癥細胞浸潤，為炎癥組織(b)；腫瘤處組織可見大量的異型性細胞，為腫瘤組織(c)。

放射性標記的氨基酸PET和SPECT顯像劑已應用于臨床，與18F-FDG聯(lián)合應用可彌補18F-FDG的不足，有助于鑒別腫瘤組織與炎癥或其他糖代謝旺盛病灶，但大多數(shù)臨床應用的氨基酸顯像劑空間構(gòu)型為L型。文獻[4–7]報道，放射性標記D-氨基酸如 2-123I-D-Phe、11C-D-MET、11C-D-CMT、18FD-FMT、18F-D-FET、18F-D-FPT等可用于腫瘤顯像，優(yōu)于各自對應的L-氨基酸。這些標記D-氨基酸為非蛋白質(zhì)組成氨基酸，主要通過氨基酸轉(zhuǎn)運機制被腫瘤攝取，很少參與蛋白質(zhì)合成，且標記D-氨基酸在血液中能較快在體內(nèi)清除，因而，標記D-氨基酸在腫瘤組織中攝取較高，而在炎癥組織中攝取較低，并能獲得較理想的腫瘤與本底放射性比值[4–7]。動物PET顯像結(jié)果表明：S180肉瘤組織攝取11C-DMCYS比炎癥組織高，與上述標記D-氨基酸有相類似的體內(nèi)攝取現(xiàn)象。其可能原因在于：11C-D-MCYS為非蛋白質(zhì)組成氨基酸，主要通過氨基酸轉(zhuǎn)運機制被腫瘤組織較高攝取，僅少量參與蛋白質(zhì)合成而造成炎癥組織低攝取。因此，11C-D-MCYS在腫瘤顯像方面具有一定潛力。11C-D-MCYS是11C-L-MCYS類似物，也可能與L-氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(LAT1)具有高親和力[8]。LAT1在多數(shù)腫瘤細胞中過度表達，而在炎癥組織細胞中低表達，因而，11C-D-MCYS 有可能通過LAT1轉(zhuǎn)運機制被S180肉瘤組織高度攝取，而被炎癥組織低攝取，但11C-D-MCYS的轉(zhuǎn)運作用機制有待進一步研究。

圖4 小鼠正常肌肉組織(a)、炎癥肌肉組織(b)和腫瘤組織(c)病理切片檢查Fig.4 Microscopic histological examination of specimens excised from normal muscle (a), inflammatory muscle(b), and tumor tissue(c) in mice, stained by hematoxylin and eosin (HE) and magnified by×400.

3 結(jié)語

11CO2與LiAlH4發(fā)生還原反應后，與HI發(fā)生取代反應生成11CH3I。11CH3I與前體D-CYS在Sep Pak Plus C18柱上發(fā)生烷基化反應生成11C-D-MCYS，總放化合成時間約為12 min，放化純度>99%。該法合成工藝簡單、合成時間短、產(chǎn)率較高。PET顯像顯示，腫瘤組織高度攝取11C-D-MCYS，而炎癥組織攝取低，表明11C-D-MCYS在腫瘤顯像方面具有一定潛力。

1 Jager P L, Vaalburg W, Pruim J, et al. Radiolabeled amino acids: basic aspects and clinical applications in oncology [J]. J Nucl Med, 2001, 42(3): 432–445

2 Tamemasa O, Goto R, Suzuki T. Preferential incorporation of some11C-labeled D-amino acids into tumor bearing animals[J]. Gann, 1978, 69(4): 517–523

3 Tamemasa O, Goto R, Taketa A, et al. High uptake of11C-labelled D-amino acids by various tumors[J]. Gann, 1982, 73(1): 147–152

4 Kersemans V, Cornelissen B, Bacher K, et al. In vivo evaluation and dosimetry of123I-2-Iodo-D-Phenylalanine, a new potential tumor-specific tracer for SPECT, in an R1M rhabdomyosarcoma athymic mouse model[J]. J Nucl Med, 2005, 46(12): 2104–2111

5 Bauwens M, Keyaerts M, Lahoutte T, et al. Intraindividual comparison of the human biodistribution and dosimetry of the D and L isomers of 2-[123I]iodophenylalanine[J]. Nucl Med Commun, 2007, 28(10): 823–828

6 Tsukada H, Sato K, Fukumoto D, et al. Evaluation of D-Isomers of O-11C-Methyl tyrosine and O-18FFluoromethyl tyrosine as Tumor-Imaging agents in tumorbearing mice: comparison with L-andD-11C- Methionine [J]. J Nucl Med, 2006, 47(4): 679–688

7 Tsukada H, Sato K, Fukumoto D, et al. Evaluation of D-isomers of O-18F-fluoromethyl, O-18F-fluoroethyl and O-18F-fluoropropyl tyrosine as tumor imaging agents in mice[J]. Eur J Nucl Med, 2006, 33(9): 1017–1024

8 Deng H, Tang X, Tang G, et al. S-11C-Methyl-L-Cysteine: A new amino acid PET tracer for cancer imaging[J]. J Nucl Med, 2011, 52(2): 287–293